Технологии современной флуоресцентной микроскопии позволили достичь беспрецедентного уровня понимания многих биологических процессов и вошли в арсенал ключевых инструментов современной биологии и молекулярной медицины. Использование подобных технологий невозможно без введения в исследуемые объекты различных меток, в роли которых могут выступать флуоресцентные белки, а также синтетические флуорофоры. К сожалению, все существующие подходы не лишены недостатков, поэтому создание новых эффективных методов флуоресцентного мечения живых систем является актуальной и важной задачей. В связи с этим, целью настоящего исследования является разработка новых молекулярных инструментов визуализации процессов, протекающих в живых системах. В рамках поставленной цели в проекте планируется реализовать три ключевых направления: 1) Расширение палитры красителей, пригодных для использования в системе флуоресцентного мечения с использованием мутантных форм лигазы липоевой кислоты. В природе эта лигаза катализирует ковалентное связывание липоевой кислоты с определенным пептидным фрагментом. Синтетические мутанты этого фермента могут аналогичным образом катализировать реакцию с флуоресцентными красителями, что может быть использовано для пострансляционного мечения белков, если в них добавлена нужная последовательность аминокислот. К сожалению, на данный момент создано лишь две мутантные формы этой лигазы, которые позволяют вводить синюю и красную флуоресцентные метки. В нашей работе мы планируем расширить этот набор за счет создания новых красителей с похожей структурой и тестирования их против масштабной библиотеки мутантных форм лигазы с измененным сусбтрат-связывающим «карманом». 2) Создание новых пар флуороген/флуороген-активирующий белок на основе хромофоров флуоресцентных белков и белков NanoLuc и Y-FAST. Помимо традиционных подходов к мечению, в которых используются объекты, имеющие постоянную флуоресценцию, недавно был разработан ряд методов основанных на использовании веществ–флуорогенов, которые не имеют выраженной флуоресценции сами по себе, однако приобретают ее при связывании с целевыми белками. Одной из перспективных групп веществ-флуорогенов являются производные хромофоров флуоресцентных белков, характеризующиеся колоссальным химическим разнообразием и широчайшей палитрой цветов. В настоящем проекте мы планируем протестировать возможность активации флуоресценции этих веществ белками NanoLuc и Y-FAST, чьи субстраты имеют очень похожее строение. Использование комбинаторной библиотеки веществ и проведение нескольких итерационных шагов тестирование-анализ-синтез-тестирование позволят добиться нужного результата. 3) Создание новых специфических низкомолекулярных сенсоров, обладающих выраженной флуорогенностью. Третьей частью настоящего проекта станет создание генетически не кодируемых меток. В роли подобных меток чаще всего используются различные сенсоры – флуорофоры, в структуре которых содержится группа чувствительная к определнному аналиту. Основной проблемой, которая возникает при использовании подобных веществ, является нецелевое мечение и наличие фонового сигнала. В настоящей работе мы предлагаем видоизменить этот подход и использовать в роли сенсоров вещетсва с выраженной флуорогенностью – упомянутые производные хромофоров флуоресцентных белков. Такие сенсоры не будут флуоресцентны в воде, а будут флуоресцировать лишь в менее полярных средах. Подобное свойство не позволит наблюдать мгновенного отклика на появление аналитов в водной среде, однако позволит избежать размывания и позволит детектировать аналиты в мембранах. Более того, эти вещества смогут стать отличными красителями, селективными в отношении отдельных органелл клеток, богатых определенными аналитами (окислителями, кислотами, тиолами и т.п.), так как накопление флуоресцентного сигнала будет происходить строго в мембранах подобных органелл. Таким образом, реализация настоящего проекта позволит предложить новые подходы к визуализации процессов, протекающих в живых системах, с помощью генетически кодируемых и некодируемых технологий флуоресцентного мечения с использованием новых флуоресцентных и флуорогенных соединений. Подобные результаты позволят достигнуть прорыва в решении задач многоцветного флуоресцентного мечения, а также визуализации быстродеградирующих белков и других актуальных направлениях, что является важной задачей, не только в фундаментальном, но и в прикладном плане.