Потенциал-чувствительные калиевые каналы (Kv) – семейство трансмембранных белков, формирующих поры в цитоплазматической мембране, которые специфичны к ионам калия и чувствительны к изменениям мембранного потенциала клетки. Члены этого семейства присутствуют в мембранах практически всех типов электровозбудимых клеток и участвуют в различных физиологических процессах, включая реполяризацию мембраны при потенциале действия и развитие гиперполяризации, передачу нервного сигнала, клеточную пролиферацию и миграцию, кальциевый сигналинг [1,2]; а также вовлечены в развитие патологических состояний: болевых [3], аутоиммунных, неврологических [4] и онкологических [5]. Направленная регуляция активности Kv не только поможет пролить свет на молекулярные основы функционирования этих сложных биологических систем, но и эффективно решать проблемы, возникающие при его нарушении. В связи с этим, Kv привлекают исследовательский интерес как перспективные мишени в направленной терапии разнообразных заболеваний, а их лиганды – модуляторы, активаторы и блокаторы, – рассматриваются (и зачастую уже используются) как специфические регуляторы активности этих белков (например, ретигабин – активатор Kv7 – противоэпилептический препарат) [6–10]. Целью данного проекта является установление на молекулярном уровне детерминант селективного действия блокаторов потенциал-чувствительных калиевых каналов из яда скорпионов с применением методов компьютерного моделирования, подходов белковой биоинженерии и молекулярной электрофизиологии. Для решения поставленных задач будет использован недавно разработанный в ИБХ РАН перспективный компьютерный метод анализа физических свойств и структуры белков – белковая топография [11], – который уже показал свою эффективность при исследовании механизмов селективности белковых нейротоксинов [12] и дизайне высокоаффинных пептидных лигандов нейрональных рецепторов [13,14]. Кроме того, планируется применение нового вычислительного подхода, основанного на анализе специфических и неспецифических контактов в молекулярных комплексах [15]. Представляемый проект является частью и логическим продолжением совместного исследования структуры и функций нейротоксинов из яда скорпионов, проводимых группой молекулярных инструментов для нейробиологии и лабораторией моделирования биомолекулярных систем ИБХ РАН. Многолетнее плодотворное сотрудничество этих подразделений позволило достичь значительных успехов на стыке компьютерного и экспериментального подходов к решению задач структурной биологии и молекулярной нейробиологии. Одним из результатов этого сотрудничества стала исчерпывающая база структурных и функциональных данных о блокаторах калиевых каналов из ядов скорпионов Kalium (http://kaliumdb.org/) [16]. Для изучения взаимосвязи физико-химических и структурных характеристик исследуемых биомолекул с их активностью на основании данных Kalium и данных сайт-направленного мутагенеза KTx и Kv будет составлена выборка токсинов, имеющих различную специфичность/аффинность взаимодействия с Kv млекопитающих. Конкретными мишенями выступят подтипы Kv1.1 – Kv1.6, поскольку: (а) для них получены наиболее полные данные о структуре и механизмах функционирования, (б) эти изоформы представляют особый интерес с точки зрения фармакологии и (в) известна кристаллическая структура «вестибюля» поры канала Kv1.2 [17], что предоставляет уникальные возможности для исследования межмолекулярных взаимодействий методами компьютерного моделирования и молекулярной динамики. Для выбранных токсинов будут получены модели пространственных структур с помощью моделирования по гомологии с родственными KTx, для которых пространственная структура изучена экспериментально. Для всех изучаемых молекул будут проведены расчеты молекулярной динамики (МД) в явно заданном водном окружении длительностью порядка 10-7с с использованием программного пакета GROMACS [18]. Это позволит изучить конформационную подвижность токсинов и учесть их динамику при анализе структурных и физико-химических особенностей. В водном растворе изучаемые пептиды представляют собой компактные глобулы, что позволяет в первом приближении рассматривать их как сферические объекты. Планируется использовать предложенный ранее метод белковой топографии для описания свойств этих молекул в терминах сферических карт-разверток, позволяющих наглядно и детально описать распределение гидрофобных (и/или электростатических) свойств и рельеф молекулярной поверхности. Метод белковой топографии основан на построении молекулярной поверхности и расчете в их точках различных физико-химических и геометрических свойств. Примерами рассчитываемых параметров являются электростатический потенциал, гидрофобные свойства (согласно формализму молекулярного гидрофобного потенциала, МГП), рельеф, локальная кривизна поверхности и другие. С использованием этого метода ранее удалось выявить базовые принципы селективного действия млеко- и инсектотоксинов из яда скорпионов, воздействующих на натриевые каналы [12], расширить понимание молекулярных механизмов работы конотоксинов, селективно действующих на никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, и создать новые высокоактивные лиганды этих рецепторов [13,14]. Преимущество метода заключается в возможности не только проводить анализ структуры и свойств отдельных молекул, но и выявлять общее и различное у представителей целых групп гомологичных белков, включающих десятки соединений. Предполагается, что развитие метода позволит выявлять физико-химические детерминанты селективного действия самых разнообразных биологически активных пептидов и белков, и, в первую очередь, блокаторов калиевых каналов – основных объектов исследования в данном проекте. Кроме того, будут построены модели молекулярных комплексов конкретных токсинов (из пула отобранных молекул) с отдельными изоформами Kv, и проведен расчет траекторий молекулярной динамики в водно-липидном окружении, имитирующем цитоплазматическую мембрану. На этом этапе работы для выявления структурно-функциональных взаимосвязей планируется применить новый комплекс подходов, основанный на учете и анализе специфических и неспецифических межмолекулярных контактов в комплексах KTx-Kv, успешно использованный нами ранее при решении задач, подобных сформулированным в настоящем проекте [15]. Результаты разных типов компьютерного анализа (описанных выше) будут обобщены, соотнесены с конкретными элементами структуры токсинов и сопоставлены с экспериментальными данными по их активности. Полученные результаты будут использованы для направленной инженерии KTx. Во-первых, будет предложен один или несколько вариантов аналогов природных KTx с заданной специфичностью; во-вторых, будет предложен набор точечных изменений структуры пептидов, исходно не обладающих блокирующей активностью в отношении Kv, которые приведут к ее появлению. Пептиды с рационально измененной структурой будут получены в бактериальной системе экспрессии с использованием подхода, зарекомендовавшего себя при выполнении подобных работ по получению дисульфид-богатых пептидов [19]. Искомые KTx будут продуцированы в специальных штаммах Escherichia coli (Origami, Shuffle) в виде химер с белком-помошником тиоредоксином, который будет затем отделен с помощью селективного протеолиза. Активность рекомбинантных KTx будет оценена в отношении целевых Kv с помощью современных методов электрофизиологии. Гены каналов будут экспрессированы в ооцитах шпорцевой лягушки, после чего влияние KTx на токи через соответствующие Kv будет измерено с использованием метода двухэлектродной фиксации потенциала (voltage clamp), что является общепринятой практикой [20].