Лаборатория работает над созданием новых флуоресцентных меток и методов флуоресцентного мечения биологических объектов. Особый интерес для нас представляют флуоресцентные белки семейства GFP (Green fluorescent protein) и другие методы неинвазивного флуоресцентного мечения, которые позволяют наблюдать структуры и процессы в живых клетках. Такие методы находят широкое применение в биомедицинских исследованиях, помогая расшифровать молекулярные механизмы разнообразных нормальных и патологических процессов и упрощая проведение доклинических испытаний лекарственных препаратов.

Лаборатория оснащена всем необходимым для проведения генно-инженерных работ, ведения культур клеток млекопитающих, флуоресцентной и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и оптической спектроскопии.

Лаборатория активно сотрудничает со многими лабораториями и группами Института: группой синтеза природных соединений ИБХ по изучению физико-химических свойств хромофоров флуоресцентных белков и созданию методов флуоресцентного мечения на основе их аналогов; с лабораторией молекулярных технологий ИБХ по разработке новых флуоресцентных сенсоров; с лабораторией рентгеноструктурного анализа ИБХ по анализу пространственной структуры флуоресцентных белков и направленному изменению их спектральных свойств; с лабораторией молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ по применению флуоресцентных инструментов для изучения индивидуального развития.

Кроме того, Лаборатория работает над исследованиями совместно с Научно-исследовательским институтом биомедицинских технологий Нижегородской государственной медицинской академии по развитию методов флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения, а также по применению флуоресцентного мечения в мышиных моделях опухолеобразования; с лабораторией физической биохимии Института биохимии им. А.Н.Баха РАН по развитию методов время-разрешенной микроскопии для анализа биологических объектов; с Кириллом Солнцевым (Georgia Institute of Technology, Atlanta, GA) по время-разрешенной спектроскопии флуоресцентных белков и хромофоров; с лабораторией Анны Крыловой (University of Southern California, Los Angeles, CA) по изучению физико-химических процессов во флуоресцентных белках; с лабораторией Владислава Верхуши (Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY) по созданию новых флуоресцентных белков; с лабораторией Jens Meiler (Vanderbilt University, Nashville, TN) по компьютерному моделированию флуоресцентных белков.

Лаборатория была образована в 2009 году (с 2009 по март 2020 носила название лаборатории биофотоники) путем выделения из лаборатории молекулярных технологий для биологии и медицины под руководством Сергея Анатольевича Лукьянова. Коллектив работает с флуоресцентными белками с 1999 года.

Новые флуоресцентные белки

GFP и другие флуоресцентные белки широко применяются как генетически кодируемые метки для визуализации белков и клеточных популяций в живых системах. Мы используем направленный и случайный мутагенез для создания новых вариантов флуоресцентных белков. Такой подход позволяет получать белки с необычными спектральными свойствами, определяемыми новыми хромофорными группами или аминокислотным окружением хромофора. Кроме того, мы работаем над улучшением таких характеристик, как яркость и фотостабильность, важных для практического применения  флуоресцентных белков. 

Chudakov DM, et al. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 2010, 90, 1103-63.

Pletnev VZ, et al. Structure of the red fluorescent protein from a lancelet (Branchiostoma lanceolatum): a novel GYG chromophore covalently bound to a nearby tyrosine. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2013, 69, 1850-60.

Sarkisyan KS, et al. Green fluorescent protein with anionic tryptophan-based chromophore and long fluorescence lifetime. Biophys J. 2015, 109, 380-9.

Mishin AS, et al. Novel uses of fluorescent proteins. Curr Opin Chem Biol. 2015, 27, 1-9.

Sarkisyan KS, et al. Local fitness landscape of the green fluorescent protein. Nature. 2016, 533, 397-401.

Bozhanova NG, et al. Yellow and Orange Fluorescent Proteins with Tryptophan-based Chromophores. ACS Chem Biol. 2017 Jul 21;12(7):1867-1873.

Povarova NV, et al. Functioning of Fluorescent Proteins in Aggregates in Anthozoa Species and in Recombinant Artificial Models. Int J Mol Sci. 2017 Jul 12;18(7). pii: E1503. doi: 10.3390/ijms18071503.

Bozhanova NG, et al. Protein labeling for live cell fluorescence microscopy with a highly photostable renewable signal. Chem. Sci., 2017, 8, 7138-7142.

Новые генетически кодируемые сенсоры

Мы ведем работу по созданию новых сенсоров на различные регуляторные активности на основе флуоресцентных белков, которые позволяют проводить количественную визуализацию целевых процессов в живых клетках. Например, недавно нами был разработан сенсор активности каскада нонсенс-опосредованной деградации мРНК (nonsense-mediated mRNA decay, NMD), а также дальнекрасный сенсор активности каспазы-3.

Gurskaya NG, et al. Analysis of alternative splicing of cassette exons at single-cell level using two fluorescent proteins. Nucleic Acids Res. 2012, 40, e57.

Pereverzev AP, et al. Method for quantitative analysis of nonsense-mediated mRNA decay at the single cell level. Sci Rep. 2015, 5, 7729.

Zlobovskaya OA, et al. Genetically encoded far-red fluorescent sensors for caspase-3 activity. Biotechniques. 2016, 60, 62-8.

Sergeeva TF, et al. Relationship between intracellular pH, metabolic co-factors and caspase-3 activation in cancer cells during apoptosis. Biochim Biophys Acta. 2017, 1864(3):604-611.

Kost LA, Nikitin ES, Ivanova VO, Sung U, Putintseva EV, Chudakov DM, Balaban PM, Lukyanov KA, Bogdanov AM. Insertion of the voltage-sensitive domain into circularly permuted red fluorescent protein as a design for genetically encoded voltage sensor. PLoS One. 2017 Sep 1;12(9):e0184225.

Фотоконверсии флуоресцентных белков

Фотоактивируемые флуоресцентные белки (ФАФБ) широко используются для слежения за движением белков, органелл и клеток в живых системах, а также во флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения. Ранее нашим коллективом были получены одни из первых ФАФБ, такие как KFP1, PS-CFP и Dendra. В настоящее время мы продолжаем работы по получению новых ФАФБ, а также созданию новых методов их применения.

В 2009 г нами была открыта окислительная фотоконверсия зеленых флуоресцентных белков, основанная на передаче электронов от хромофора на молекулу внешнего акцептора электронов. Мы продолжаем исследование механизмов данного явления и разработку методов его практического использования (например, для увеличения фотостабильн ости флуоресцентных белков).

В сотрудничестве с Нижегородской медицинской академией мы работаем над новыми метками и методами флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения на основе детекции единичных молекул (локализационная микроскопия единичных молекул PALM/STORM).

Chudakov DM, et al. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat Biotechnol. 2003, 21, 191-4. 

Gurskaya NG, et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat Biotechnol. 2006, 24, 461-5.

Bogdanov AM, et al. Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nat Chem Biol. 2009, 5, 459-61.

Bogdanov AM, et al. Cell culture medium affects GFP photostability: a solution. Nat Methods. 2009, 6, 859-60.

Mamontova AV, et al. Influence of cell growth conditions and medium composition on EGFP photostability in live cells. Biotechniques. 2015, 58, 258-61.

Bogdanov AM, et al. Turning On and Off Photoinduced Electron Transfer in Fluorescent Proteins by π-Stacking, Halide Binding, and Tyr145 Mutations. J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 4807-4817.

Acharya A, et al. Photoinduced Chemistry in Fluorescent Proteins: Curse or Blessing? Chem Rev. 2017 Jan 25;117(2):758-795.

Klementieva NV, et al. Green-to-red primed conversion of Dendra2 using blue and red lasers. Chem Commun (Camb). 2016 Nov 18;52(89):13144-13146.

Klementieva NV, et al. Intrinsic blinking of red fluorescent proteins for super-resolution microscopy. Chem Commun (Camb). 2017 Jan 10;53(5):949-951.

Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы

Фототоксичные флуоресцентные белки, первый из которых – KillerRed – был создан нами в 2006 году, продуцируют активные формы кислорода (АФК) при облучении светом. Мы продолжаем развитие данной оптогенетической технологии, которая дает возможность создавать окислительный стресс в целевых клеточных компартментах, инактивировать белки и вызывать клеточную гибель специфических клеточных популяций с помощью света.

Bulina ME, et al. A genetically encoded photosensitizer. Nat Biotechnol. 2006, 24, 95-9.

Lukyanov KA, et al. Fluorescent proteins as light-inducible photochemical partners. Photochem Photobiol Sci. 2010, 9, 1301-6.

Serebrovskaya EO, et al. Phototoxic effects of lysosome-associated genetically encoded photosensitizer KillerRed. J Biomed Opt. 2014,19, 071403.

Sarkisyan KS, et al. KillerOrange, a Genetically Encoded Photosensitizer Activated by Blue and Green Light. PLoS One. 2015, 10, e0145287.

2002—2006. Создана панель фотоактивируемых флуоресцентных белков с различным типом свето-индуцируемых спектральных переходов: нефлуоресцентный→красный (KFP1), голубой→зеленый (PS-CFP) и зеленый→красный (Dendra). Продемонстрирована применимость KFP1, PS-CFP и Dendra для прицельного фотомечения клеток, внутриклеточных органелл и белков и последующего слежение за их перемещениями, а также для мониторинга деградации целевых белков на уровне отдельных клеток в реальном времени с помощью флуоресцентной и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

2005—2006. Создан первый генетически кодируемый фотосенсибилизатор — фототоксичный красный флуоресцентный белок, названный KillerRed, который может быть использован для прицельного свето-индуцированного уничтожения клеток и белков.

2005—2007. Методами направленной молекулярной эволюции получены улучшенные флуоресцентные белки, адаптированные к практическому применению. В частности, получены красные и дальне-красные белки, превосходящие по яркости все известные аналогичные флуоресцентные белки, разработанные в других лабораториях мира. Яркие дальне-красные флуоресцентные белки открывают новые перспективы флуоресцентного мечения лабораторных животных на уровне целых организмов.

2005—2008. Впервые осуществлен синтез «красных» хромофоров природных GFP-подобных белков — asFP595, Kaede и их аналоги. Данная работа позволила выявить закономерности влияния различных заместителей на спектральные свойства хромофоров, а также предложить перспективные направления мутагенеза флуоресцентных белков с целью получения вариантов с новыми спектральными характеристиками.

Научные проекты

Загрузка...

Гурская Н.Г.

Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 — На карте