Пресс-центр / новости / Отчеты /

Информация о ходе выполнения проекта Минобрнауки России по Соглашению № 075-15-2023-589

Информация о ходе выполнения 1 этапа проекта Минобрнауки России "Создание и тестирование эффективной ДНК-вакцины для профилактики бруцеллёза" по Соглашению № 075-15-2023-589 от 11.08.2023 г.

Григоров А.С.

За отчетный период 1 этапа (11.08.2023 – 31.12.2023) в рамках выполнения проекта были проведены следующие работы:

  • Выполнение аналитического обзора информационных источников по теме проекта.
  • Проведение патентных исследований в соответствии с ГОСТ Р 15.011-2022.
  • Разработка дизайна последовательностей ДНК-плазмид, необходимых для создания вариантов вакцины, и контрольных плазмид.
  • Создание ДНК-плазмиды для получения миникольца, кодирующего белки бруцеллы. Получение бактериального штамма, содержащего целевую плазмиду.
  •  Оптимизация методики выделения и очистки миникольца.
  • Наработка миникольца в препаративных количествах.
  • Подбор оптимальных условий трансфекции миникольца на культурах клеток. Получение ЭО ДНК-вакцины на основе миникольца.
  • Тестирование первых вариантов ДНК-вакцины на модельных животных (выполнено иностранным партнером).

В результате выполнения работ 1 этапа получены следующие основные результаты:

  1. Был подготовлен аналитический обзор современной научно-технической литературы, включающий информацию о предшествующих попытках создания вакцин против бруцеллёза, новых подходах к созданию ДНК-вакцин, способах их доставки, использовании молекулярных адъювантов для повышения эффективности вакцин, подходах к наработке и очистке ДНК для получения вакцины. Также были проведены патентные исследования с целью определения уровня научных исследований в предметной области. Было принято решение использовать для вакцинации множественные антигены бруцеллы, так как, по результатам анализа литературы и экспериментальным данным, полученным нами ранее, такой подход позволяет добиться более сильного защитного эффекта при вакцинации, чем в случае использовании отдельных антигенов. Кроме того, использование нескольких белков для иммунизации позволит повысить надёжность защиты от различных штаммов бруцеллы. Было отобрано 6 белков бруцеллы для использования кодирующих их последовательностей при создании ДНК-вакцины; выбран подход, при котором все шесть белков кодируются одной мРНК. Последовательности, кодирующие первые три белка, разделены последовательностями саморасщепляющихся пептидов P2A и Т2A. Далее идёт хорошо известный IRES-элемент из полиовируса (doi: 10.1038/334320a0), после которого расположены участки, кодирующие остальные три белка, также разделённые последовательностями саморасщепляющихся пептидов. Данную последовательность получали методом синтеза генов, поэтому мы провели оптимизацию последовательностей, кодирующих требуемые белки, для наиболее эффективной экспрессии в клетках млекопитающих (в основном учитывалась частота встречаемости кодонов). К началу последовательностей, кодирующих несекреторные белки, после старт-кодона были добавлены последовательности сигнального пептида из гена, кодирующего Igκ подгруппы V человека (аминокислотная последовательность: METPAQLLFLLLLWLPDTTG, https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29281112/). Данный сигнальный пептид часто используется для секреции гетерологичных белков. Было решено создать три типа ДНК-векторов, а именно - на основе обычного плазмидного вектора, миникольца и на основе ДНК-кодируемой самоамплифицирующейся РНК.
  2. Была создана ДНК-плазмида для получения миникольца, кодирующего белки бруцеллы. Для получения миниколец было решено использовать технологию «MC-Easy» фирмы Systembio. Данная технология позволяет проводить рекомбинацию родительской плазмиды с образованием миниколец прямо внутри бактериальных клеток, что упрощает процесс производства миниколец и снижает их стоимость. Вначале полученная методом синтеза генов кассета, кодирующая белки бруцеллы, была перенесена под контроль цитомегаловирусного промотора в векторе pEGFP-N1. Затем кассета вместе с цитомегаловирусным промотором была перенесена в вектор для получения миниколец pMC.EF1α-MCS-SV40polyA фирмы Systembio. Последовательности полученных плазмид полностью соответствовали теоретическим последовательностям, что было подтверждено секвенированием по Сэнгеру. Получившаяся плазмида была трансформирована в бактериальный штамм ZYCY10P3S2T (SystemBio), позволяющий при добавлении индуктора (арабиноза) проводить рекомбинацию родительской плазмиды с образованием миникольца.
  3. Была проведена оптимизация методики наработки и очистки миникольца. Среди оптимизируемых параметров наработки биомассы были температура роста ночной культуры и температура роста биомассы после добавления индуктора, тип питательной среды, контроль уровня рН. Показано, что наиболее существенным фактором является контроль рН среды (не следует допускать его снижения до низких значений). В лабораторных условиях можно частично решить проблему закисления среды в процессе роста биомассы добавлением в питательный бульон гидрооксида натрия. В результате проведённой оптимизации выход миникольца повысился с 0.17 мкг/на миллилитр конечного объёма биомассы до 1.6 мкг/мл. Также было показано, что относительно невысокий выход миникольца объясняется не потерями на этапе рекомбинации или низкой копийностью плазмиды, а невысоким количеством родительской плазмиды в штамме ZYCY10P3S2T. Наработка родительской плазмиды в штамме ZYCY10P3S2T и в штамме XL-1 показала различие в выходе плазмиды примерно в 10 раз, в пользу штамма XL-1. Была проведена оптимизация лабораторной методики очистки плазмидной ДНК: изучалась возможность упрощения методики с сохранением приемлемого уровня чистоты конечной ДНК. Было показано, что добавление хлорида кальция на этапе щелочного лизиса в комбинации с последующим осаждением плазмидной ДНК полиэтиленгликолем действительно позволяет быстро получать достаточно чистую ДНК с невысокими примесями РНК без использования РНКазы А (использование РНКазы нежелательно в промышленном производстве, так как это продукт животного происхождения), однако общий выход плазмиды при использовании такой методики несколько ниже. Для проведения последующих испытаний было проведено получение миникольца в количестве 12 мг.
  4. Была проведена оптимизация методики трансфекции на культурах клеток млекопитающих. Использовались клетки HEK293. В качестве реагентов для трансфекции использовали линейный полиэтиленимин фирмы Polyscience (вариант PEImax) и реагенты для трансфекции GenJect39 и GenJect41 фирмы Молекта. Для трансфекции использовалась контрольная плазмида, экспрессирующая люциферазу светлячка. Для каждого трансфектанта были подобраны оптимальные соотношения ДНК:трансфектант, обеспечивающие наибольший уровень экспрессии люциферазы. С использованием прибора «Zetasizer nano zs» был определён размер комплексов ДНК:трансфектант при различных условиях образования комплексов. Показано, что ДНК в комплексе с полиэтиленимином образует более однородные по размеру комплексы, чем с реагентами серии GenJect. Кроме того, в выбранных условиях комплексы ДНК:PEImax оказались более стабильными и в целом сохраняли свою структуру в течение 2 дней хранения при +4 градусах Цельсия. Был получен ЭО ДНК-вакцины, представляющих собой набор компонентов для приготовления трансфекционных комплексов ДНК:PEImax.
  5. Иностранным партнёром было проведено тестирование различных вариантов вакцины на мышах. Через 16 дней после иммунизации мышам вводился тестовый штамм бруцеллы (Brucella melitensis), а ещё через 16 дней – проводился забор крови и высев биоматериала из разных органов на чашки с питательной средой с последующим подсчётом колониеобразующих единиц бруцеллы. Показано, что однократная вакцинация ДНК-вакциной в некоторых вариантах действительно защищает мышей от последующего заражения тестовым штаммом бруцеллы, хотя и в меньшей степени, чем при вакцинации контрольной вакциной на основе вакцинного штамма бруцеллы. Статистически значимых отличий от использования плазмидного вектора и миникольца выявлено не было. Внутримышечные инъекции оказались более эффективны, чем подкожные.

Все задачи 1 этапа работ выполнены в установленные сроки в соответствии с Планом работ научного исследования (приложение № 13 к Соглашению № 075-15-2023-589 о предоставлении субсидии от 11.08.2023 г.).

23 июля