Адресная терапия опухолей и удаленных метастазов каждого конкретного пациента - основополагающая задача современной онкологии. Выбор схемы лечения, равно как успешность терапии, определяются индивидуальным молекулярным профилем опухоли. Для снижения побочных эффектов в процессе терапии представляется перспективным использовать ступенчатую доставку действующих агентов, или претаргетинг: на первой стадии к клетке определенного молекулярного профиля избирательно доставляется нетоксичный адресный модуль (антитело, неиммуноглобулиновые скаффолды), а на второй стадии - цитотоксический агент (токсины, радиоактивные изотопы), способный специфически взаимодействовать с адресным модулем, предварительно связавшимся с опухолевой клеткой-мишенью. Предполагается, что такая схема введения цитотоксического агента позволит улучшить его фармакокинетику и биораспределение, увеличить соотношение опухоль/органы, что в свою очередь позволит уменьшить пассивное поглощение цитотоксического агента здоровыми тканями и таким образом, снизить нежелательные побочные эффекты. Ключевой проблемой в системе ступенчатой доставки лекарства является высокоточное связывание in vivo адресного модуля и цитотоксического агента. С 1985 г. к решению этой проблемы разработано 4 основных подхода, основанных: 1) на нековалентном взаимодействии между стрептавидином и биотином (KD 10^15 М-1); 2) на использовании биспецифичных антител, способных взаимодействовать с мишенью на поверхности опухолевой клетки и с введенным цитотоксическим агентом (например, система «dock-and-lock» (Rossi E. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006, 103, 6841–6846); 3) на гибридизации комплементарных олигонуклеотидов (Westerlund K. et al. J. Nucl. Med. 2018, 59, 1092-1098); 4) на биоорганической клик-химии на основе тетразина и транс-циклоэтена (Altai M. et al., J. Nucl. Med. 2017, 58, 1553-1559). В тоже время проблема еще далека от разрешения, поскольку каждый из этих подходов имеет свои ограничения (гидрофобность, высокая иммуногенность и аллергенность стрептавидина, присутствие эндогенного биотина в организме; невысокая аффинность связывания компонентов с наномолярной константой диссоциации и биотехнологические проблемы производства биспецифических антител (агрегация, проблема растворимости), что приводит к дороговизне конечного продукта; в случае с синтетическими олигонуклеотидами селективность и скорость гибридизации очень сильно зависит от конкретной последовательности, также есть проблемы с растворимостью; нестабильность тетразина и транс-циклоэтена in vivo). Очевидно, что востребованы новые решения и подходы. Поэтому предлагаемая в данном проекте новая технология ступенчатой доставки обладает высокой степенью актуальности. В своей работе мы предлагаем систему ступенчатой доставки лекарства, в которой для высокоточного связывания in vivo адресного модуля и цитотоксического (или визуализирующего) агента впервые используется молекулярная пара барназа-барстар. Предполагается, что адресный модуль будет представлять собой белковый гибрид анти-HER2-скаффолда с одним из компонентов пары барназа-барстар, в то время как второй компонент этой пары будет связан с цитотоксическим (или визуализирующим) агентом. Для претаргетинга HER2-положительных опухолей мы предлагаем использовать инновационные неиммуноглобулиновые скаффолды – DARPins (Design Ankyrin Repeat Proteins), специфически взаимодействующие с различными эпитопами онкомаркера HER2 с константой диссоциации в наномолярном диапазоне (Boersma Y. et al. Curr. Opin. Biotechnol. 2011, 22, 849–857) и/или аффибоди (Löfblom J. et al. Curr. Opin. Biotechnol. 2011, 22, 843–848). Барназа и барстар - два небольших белка из Bacillus amyloliquefaciens, способных быстро образовывать прочный комплекс (KD 10^-14 М) (Hartley R.W. Methods Enzymol. 2001, 341, 599–611). Существенным преимуществом предлагаемой системы является гораздо более сильное взаимодействие (на 4-5 порядков больше) компонентов пары барназа-барстар, используемое на второй стадии доставки цитотоксического агента по сравнению со взаимодействием адресного модуля с опухолевой клеткой на первой стадии доставки, что в конечном итоге должно обеспечить быстрое, прочное и высокоселективное связывание цитотоксического агента с мишенью. В качестве цитотоксического агента предполагается в первую очередь использовать фрагмент псевдомонадного токсина PE40, который будет использован как в составе гибридного рекомбинантного белка с одним из компонентов пары барназа-барстар, так и в составе липосомной конструкции. Липосомы, нагруженные цитотоксическим белком, могут оказаться более функционально эффективными, чем «голый» белок, поскольку, во-первых, будет снижена иммуногенность чужеродного белка PE40, во-вторых, сам он будет защищен от деградации во время циркуляции по кровотоку. Для отработки системы доставки желательно иметь возможность визуализации доставляемой конструкции. Для этого предлагается дополнить цитотоксический агент визуализирующей меткой, в качестве которой могут быть использованы инфракрасные флуоресцентные белки (например, iRFP (Filonov G. et al. Nat. Biotechnol. 2011, 29, 757–761), λex/em 690/713 нм), и/или красители (например, iRDye800). Научная новизна проекта заключается в том, что впервые в мире в системе поэтапной доставки терапевтического агента к опухолевой клетке будет применена молекулярная пара барназа-барстар, обладающая рядом существенных преимуществ по сравнению с существующими на сегодняшний день подходами. Предлагаемый подход является новым применением оригинальной авторской технологии, которая ранее была использована для конструирования мультивалентных антител (Deyev S. et al. Nat. Biotechnol. 2003, 12, 1486-1492).