За последние несколько лет были разработаны новые технологии, обеспечивающие выполнение логических операций генетическими конструкциями в живых клетках. В частности, были разработаны генетические конструкции, позволяющие проводить цифровые и аналоговые вычисления, обеспечивать долговременную память о событиях внешней среды и производить логические операции для ответа на внешние события. Для дизайна и разработки конструкций, обеспечивающих выполнение в клетке произвольных логических операций был разработан язык программирования Cello. Одновременно с этим появились основанные на фоторецепторах бактериальные оптогенетические инструменты, позволяющие точно контролировать экспрессию генов в бактериях с помощью света и обладающие широким динамическим диапазоном. Перечисленные технологии были разработаны в течение последних двух-трех лет и пока не были интегрированы в современные методы, основанные на скринингах библиотек флуоресцентных и люминесцентных белков. Настоящий проект ставит задачей такую интеграцию: целью проекта является перенесение процесса скрининга внутрь клетки и переложение принятия решения о функциональности мутантного гена с исследователя на саму клетку, таким образом замещая скрининг селекцией клеток. Иными словами, задачей проекта является создание клетки, способной измерять интенсивность собственного свечения и транслировать этот сигнал в уровень экспрессии селективного маркера. В этом случае трудоемкий процесс скрининга библиотек генов может быть заменен на простую селекцию клеток на среде с антибиотиком. Для решения этой задачи мы планируем разработать генетическую конструкцию, при экспрессии которой бактериальная клетка становится чувствительной к собственной биолюминесценции и флуоресценции и активирует транскрипцию селективных маркеров пропорционально интенсивности излучаемого света. Таким образом, ярко светящиеся клетки, экспрессирующие такую конструкцию, будут также сильно экспрессировать ген устойчивости к антибиотику, в то время как в несветящихся клетках экспрессия будет подавлена. Помещение клеток в среду с антибиотиком позволит отбирать клетки, испускающие наибольшее количество света, причем сила отбора будет контролироваться концентрацией антибиотика в среде. Описанные конструкции будут созданы на основе недавно разработанных светочувствительных двухкомпонентных систем бактерий, позволяющих количественно контролировать экспрессию генов в Escherichia coli интенсивностью света определенной длины волны. Фоточувствительные двухкомпонентные системы бактерий представляют собой пару белков: сенсорную гистидин-киназу, поглощающую свет, и так называемый “регулятор ответа” – транскрипционный фактор, активность которого светозависимо регулируется гистидин-киназой. Для достижения целей проекта – регуляции экспрессии генов с помощью света, производимого самой клеткой, – необходимо обеспечить передачу света с испускающей его молекулы внутри клетки на фоторецептор. Кроме того, для селекции бактерий с помощью антибиотика необходимо поместить ген устойчивости к антибиотику под контроль фоточувствительного каскада. Для того, чтобы обеспечить передачу света с испускающих его молекул на фоторецепторы, гены скринируемой библиотеки будут слиты с генами фоторецепторов: в результате этого в химерных белках испускаемый свет будет передаваться на фоторецепторы с помощью Ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET), а степень активации сигнального каскада будет зависеть от количества передаваемого света. В случае библиотек биолюминесцентных белков для эффективного переноса энергии достаточно обеспечить перекрытие спектров люминесценции со спектром поглощения фоторецептора, а насыщение активности сигнального каскада можно регулировать концентрацией субстрата биолюминесцентной реакции. В случае библиотек флуоресцентных белков необходимо также контролировать, что возбуждение флуоресцентных белков происходит светом, который сам по себе не приводит к возбуждению фоторецептора. Реалистичность создания такой технологии подтверждается недавней разработкой люминопсинов – химерных белков, состоящих из биолюминесцентного белка и родопсина, в которых свет, производимый люминесцентным белком, приводит к активному переносу протонов через мембрану клетки и генерации потенциала действия. Функциональность люминопсинов иллюстрирует, что оптогенетические конструкции, активируемые испускаемым in situ светом, возможны и эффективны. В случае успешного функционирования разрабатываемых генетических конструкций, следующим шагом на пути к автоматизированному скринингу библиотек генов люминесцентных и флуоресцентных белков станет их интеграция с конструкциями, обеспечивающими выполнение логических операций. Клетки, способные оценить функциональность анализируемого гена в различных условиях, интегрировать эту информацию и “оценить” успешность экспрессируемого ими варианта гена, принципиально упростят технологии разработки генетически кодируемых сенсоров. Наиболее высокопроизводительным методом отбора флуоресцентных маркеров на сегодняшний день является клеточный сортинг (FACS), позволяющий проанализировать десятки или сотни миллионов клеток. Для люминесцентных маркеров высокопроизводительных методов скрининга фактически нет, и отбор более люминесцентных вариантов обеспечивается вручную или в формате роботизированного скрининга в 96-луночных плашках. В отличие от перечисленных методов, разрабатываемый в настоящем проекте подход позволит отбирать более яркие клетки из популяций с разнообразием в миллиарды или потенциально триллионы вариантов без необходимости продолжительной работы людей или использования роботов. В сочетании с системами непрерывной эволюции и геноспецифичным мутагенезом in vivo, разрабатываемая технология может полностью автоматизировать направленную эволюцию флуоресцентных и биолюминесцентных веществ.