Потенциал-чувствительные натриевые (Na) каналы — важнейшая группа мембранных белков, обусловливающих способность нейронов и миоцитов генерировать потенциалы действия. Неудивительно поэтому, что Na каналы являются мишенью действия огромного разнообразия природных токсинов и лекарственных веществ, а их неправильная работа (дисфункция) приводит к большому числу заболеваний. Главная альфа-субъединица Na каналов включает поровый домен (pore domain в англоязычной литературе) и четыре потенциал-чувствительных домена (voltage-sensing domains). Поровый домен может находиться в закрытом, открытом или инактивированном состояниях. Потенциал-чувствительные домены могут находиться в состояниях активации (up) или покоя (down). Геном человека содержит девять изоформ Na каналов. Важно, что многие природные нейротоксины избирательно связываются с определенными состояниями различных изоформ каналов. Недавно установлена пространственная структура нескольких Na каналов с предположительно инактивированным поровым доменом и up и down состояниями потенциал-чувствительных доменов. При этом впервые получить структуру down-состояния удалось именно с использованием природных токсинов, которые в данном случае выступают как молекулярные инструменты биохимических исследований. Это открыло беспрецедентные возможности изучения структуры и механизмов работы Na каналов в различных состояниях, в частности, при патогенных мутациях у человека. В рамках данного проекта мы планируем выполнить работы по трем тесно взаимосвязанным направлениям. 1. Нейротоксины. Прогресс в исследовании Na каналов во многом зависит от использования их селективных лигандов. Na каналы впервые были идентифицированы как очищенные белковые комплексы с помощью нейротоксинов как специфичных меток. Дальнейшее использование токсинов позволило понять функцию различных доменов каналов. Получены лиганды, проявляющие специфичность в отношении Na каналов различных животных или отдельных изоформ каналов одного животного. С 2004 г. в качестве анальгетика используется нейротоксин из яда улитки, а в 2018 г. Агентство по охране окружающей среды США разрешило к применению новый биоинсектицид на основе нейротоксина паука, что подстегнуло интерес к природным инсектотоксинам, среди которых особое место принадлежит модуляторам Na каналов. Ведущими исследовательскими группами и фармацевтическими компаниями проводится поиск специфичных лигандов Na каналов, являющихся мишенями при эпилепсии, аритмии, миотонии, параличе, болевых синдромах. У нашей группы есть богатый опыт исследования пептидных нейротоксинов и создания новых соединений на их основе. В рамках предлагаемого проекта мы разработаем лиганды мутантных каналов, характерных для эпилепсии и паралича. Основой для успешного выполнения намеченных планов служит имеющийся у нас задел в области нейротоксинов из яда пауков и скорпионов, воздействующих на Na каналы. Проект представит существенную научную новизну: в настоящее время очень малочисленны примеры лигандов, селективно действующих на мутантные каналы. 2. Молекулярное моделирование Na каналов и их комплексов с нейротоксинами. Экспериментальные структуры, как и структуры, предсказанные нейросетью AlphaFold 2, показывают натриевые каналы в энергетически предпочтительном состоянии с инактивированным поровым доменом и активированными потенциал-чувствительными доменами. Для понимания механизмов дисфункции мутантных каналов у больных и для предсказания структуры комплексов каналов с лекарствами и токсинами нужны структуры каналов с открытым или закрытым поровым доменом и потенциал-чувствительными доменами в состоянии покоя. Этот пробел может восполнить молекулярное моделирование. У нашего коллектива есть богатый опыт моделирования Na каналов и их комплексов с лекарственными веществами и токсинами. Некоторые наши предсказания подтверждены последующими экспериментально установленными структурами. Примерами являются локализация гидрофобного пути блокаторов в закрытый канал, структура комплекса канала с тетродотоксином, механизм блокады поры катионными лигандами. Мы построим модели каналов в различных состояниях и осуществим докинг нейротоксинов. Мы далее построим модели мутантных каналов в разных состояниях и проанализируем энергетику контактов соответствующих остатков. Это позволит не только объяснить механизм дисфункции каналов, но и предложить способы купирования дисфункции нейротоксинами. Важно, что мы ранее показали принципиальную возможность такого подхода: мы выяснили, что нейротоксин паука, подавляющий активацию Na каналов, ингибирует аберрантные «омега-токи» в мутантных каналах Nav1.4, являющиеся причиной периодического паралича. 3. Патофизиология Na каналов. В настоящее время у нас сформирована выборка генотипированных больных с эпилепсией и задержкой развития в российской популяции с мутациями в гене канала Nav1.1 — 100 пациентов. Мы планируем расширить эту выборку с использованием панели кандидатных генов и метода высокопроизводительного секвенирования. Кроме того, в международной базе данных ClinVar описано несколько тысяч вариантов Na каналов у людей, страдающих эпилепсиями, параличом и другими неврологическими или нервно-мышечными заболеваниями. При этом клиническая значимость более четверти этих вариантов неизвестна. Предсказание этой значимости исключительно важно для людей, проходящих генетический анализ. Недавно нами разработан метод предсказания патогенности вариантов канала Nav1.5, использующий биоинформатический подход и анализ патогенных вариантов у паралогов. Используя этот метод, мы отберем среди мутантных каналов те, которые с очень большой долей вероятности являются патогенными. С помощью молекулярного моделирования мы далее отберем те варианты, у которых стабилизированы (или дестабилизированы) определенные состояния потенциал-чувствительных доменов. Мы экспрессируем гены этих мутантов в ооцитах Xenopus laevis и изучим влияние мутаций на электрофизиологические характеристики каналов. Мы сравним влияние полученных нами нейротоксинов, специфичных к тому домену, где находится исследуемая мутация, на канал дикого типа и мутант. Полученные данные будут важны для создания низкомолекулярных веществ, купирующих приступы заболеваний.