Пресс-центр / новости / Наука /
Двухцветные светящиеся репортеры позволяют количественно измерять экспрессию генов независимо от метаболизма
В журнале Nature Plants опубликована работа международного коллектива авторов под руководством исследователей из ГНЦ ИБХ РАН, в которой предложен и проверен простой и изящный способ сделать автономно люминесцентные репортеры устойчивыми к изменениям в метаболизме. Исследователи создали пары люцифераз, использующих один и тот же субстрат, но излучающих свет разного цвета, и показали, что отношение сигналов двух цветов отражает активность гена-репортера, а не метаболическое состояние клетки. Таким образом появляется возможность отслеживать фитогормональные и защитные реакции растений на длительных промежутках времени.
Биолюминесцентные репортеры широко используются для изучения активности генов в растениях, позволяя отслеживать изменения экспрессии в пространстве и времени. В основе их работы лежит реакция окисления люциферина, катализируемая ферментом люциферазой и сопровождающаяся испусканием света. Для работы таких репортеров обычно необходимо добавлять люциферин извне.
Ранее исследователи из ГНЦ ИБХ РАН показали, что растения могут самостоятельно синтезировать люциферин с помощью ферментов, обнаруженных у светящихся грибов. Такие трансгенные растения способны светиться автономно, без добавления субстрата, что открывает возможности для непрерывного и длительного наблюдения за активностью генов.
Однако у таких репортеров есть существенный недостаток: интенсивность свечения зависит не только от активности исследуемого гена, но и от метаболического состояния клетки. Поэтому снижение яркости может свидетельствовать как об уменьшении экспрессии гена, так и о снижении доступности люциферина, необходимого для биолюминесценции, даже если активность гена остается неизменной.
Именно эту проблему решает новая работа.
Идея авторов была проста: если в одной клетке одновременно экспрессировать две люциферазы, которые используют один и тот же субстрат-люциферин, но светятся в разных диапазонах спектра, то отношение интенсивностей их свечения будет зависеть от относительного количества этих ферментов, а не от концентрации субстрата или общего метаболического статуса. Одна люцифераза служит «репортером» (ее ген ставят под изучаемый промотор), а вторая — «референсом» (под конститутивный промотор). Отношение красного и зеленого сигналов, то есть рациометрический сигнал, дает количественную меру активности промотора.
Чтобы реализовать эту схему, нужно было получить люциферазы, излучающие свет с максимумами эмиссии разных длин волн, но использующие один субстрат. Для грибного пути биолюминесценции красных вариантов практически не существовало. Исследователи использовали стратегию BRET — биолюминесцентного резонансного переноса энергии. Они встраивали флуоресцентные белки (tdTomato, mScarlet, mKate2) в различные участки люциферазы, чтобы энергия от реакции окисления люциферина передавалась на флуорофор и излучалась в красной области спектра.
Сначала авторы просканировали последовательность люциферазы, вставляя и удаляя фрагменты, чтобы найти позиции, толерантные к структурным изменениям. Затем, комбинируя оптимальные точки вставки, улучшенный вариант люциферазы (Luz533) и оптимизированные линкеры, они получили три варианта: Luz593, Luz608 и Luz640. Все они сохраняли яркость, достаточную для визуализации, и давали заметный сдвиг спектра. Самый «красный» вариант Luz640 имел наибольшее спектральное разделение, но для дальнейших экспериментов выбрали Luz593 и Luz608 из-за более высокой яркости.
Исследователи убедились, что введение флуоресцентного белка не дестабилизирует люциферазу: период полужизни Luz533 и Luz608 в клетках BY-2 составил около 9–10 часов.
Затем авторы одновременно экспрессировали зеленую и красную люциферазы под сильными конститутивными промоторами и обработали клетки растений тидиазуроном — синтетическим регулятором роста, изменяющим гормональный баланс и метаболизм. В контрольных условиях интенсивность свечения могла меняться в несколько раз, но отношение красного сигнала к зеленому оставалось стабильным.
Наконец, были проведены эксперименты на трансгенных растениях Arabidopsis thaliana. Авторы использовали «мастер-линию», которая синтезирует люциферин, но лишена люциферазы. В нее вводили конструкции, где зеленой люциферазой управляли промоторы WRKY70 (участвует в сигналинге салициловой кислоты) или ORCA3 (ранний ответ на жасмоновую кислоту), а красная люцифераза служила референсом.
Трехдневная визуализация растений с репортером WRKY70 показала, что несмотря на значительные колебания общей интенсивности свечения отношение сигналов оставалось стабильным в отсутствие индукторов салициловой кислоты. Более того, исследователи наблюдали «мерцающие» паттерны иммунной активности в листьях розетки – и рациометрический сигнал позволял их отслеживать. При обработке ацетилсалициловой кислотой рациометрический сигнал совпал с результатами измерения транскрипции.
На линии с репортером ORCA3 смоделировали реакцию на заражение бактериальным патогеном Pseudomonas savastanoi. Рациометрическое изображение выявило локальную зону ответа вокруг места инфекции на фоне ярко светящихся жилок, которые сильно варьировали по интенсивности. Без рациометрической поправки такие слабые локальные сигналы было бы трудно различить.
Разделяя изменения активности генов и колебания клеточного метаболизма, двухцветные биолюминесцентные репортеры позволяют количественно, неинвазивно и на протяжении длительного времени отслеживать экспрессию генов в живых растениях. Разработанная технология открывает новые возможности для изучения развития растений, фитогормональной регуляции и ответных реакций на стрессовые факторы окружающей среды и патогены.
29 октября