Пресс-центр / новости / Отчеты /
Информация о ходе выполнения проекта Минобрнауки России по Соглашению № 075-15-2023-610
Информация о ходе выполнения 1 этапа проекта Минобрнауки "Создание платформы для скрининга гербицидов на основе генетически кодируемой биолюминесценции" по Соглашению №075-15-2023-610 от 30.08.2023 г.
За отчетный период 1 этапа (30.08.2023 – 31.12.2023) в рамках выполнения соглашения были проведены следующие работы:
- Дизайн единой транскрипционной единицы, кодирующей систему биолюминесценции грибов.
- Сборка плазмид, несущих варианты компактной биолюминесцентной системы грибов под конститутивным промотором.
- Сборка плазмиды, несущей наиболее эффективно конститутивно экспрессируемую компактную биолюминесцентную систему под триггер-активируемым промотором, подходящим для скрининга гербицидов.
- Проведение патентных исследований.
В результате выполнения работ 1 этапа работ по Соглашению № 075-15-2023-610 о предоставлении субсидии получены следующие основные результаты:
1. Был выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей (а) разработку слитных белков – фьюзов, (б) создание генетических конструкций, (в) методы стабильной трансформации растений, (г) проведения биоимиджинга, (д) статистический анализ. Была проведена сравнительная оценка вариантов возможных решений с учетом результатов прогнозных исследований, проводившихся по аналогичным тематикам.
2. Была создана компактная биолюминесцентная система грибов, которая необходима для облегчения процесса создания генетических конструкций и увеличения эффективности стабильной трансформации растений. Разрабатываемая компактная версия пути биолюминесценции грибов основана на циклическом превращении кофейной кислоты — вторичного метаболита, присутствующего в грибах и растениях в значительном количестве. Биосинтез люциферина грибов — 3-гидроксигиспидина основан на экспрессии пяти ферментов: 3 необходимы для превращения кофейной кислоты в люциферин (гиспидинсинтаза, гиспидин-3-гидроксилаза, фосфопантетеинилтрансфераза для посттрансляционной модифицкации гиспидинсинтазы) и люцифераза для окисления люциферина и эмиссии света. Разрабатываемая компактная версия система биолюминесценции грибов не вызывает токсическое воздействие при экспрессии в клетках растений.
Подходом для создания компактной биолюминесцентной системы стало сокращение числа транскрипционных единиц до одной, кодирующей систему биолюминесценции грибов. В процессе работы были созданы несколько дизайнов белков слияния – фьюзов генов биолюминесцентной системы, которые были помещены под контроль одного промотора. Для достижения максимально возможной яркости при дизайне вариантов компактной биолюминесцентной системы были предусмотрены варианты с различной ориентацией доменов – белков исходной биолюминесцентной системы и выбрана оптимальная топология слияния белков. Оптимальная ориентация доменов была достигнута путем выбора оптимального для экспрессии (а) порядка белков и (б) соединяющих их линкеров. Быть отобран ряд комбинаций генов биолюминесцентной системы – гиспидинсинтазы HispS, люциферазы Luz, гиспидин-3-гидроксилазы H3H, каффеоилпирувагидролазы CPH, фермента, осуществляющего фосфопантетеинилирование HispS – npgA. Комбинации генов биолюминесцентной системы были получены случайным упорядочиванием генов или на основе имеющихся в лаборатории предварительных данных по теме создания белков-фьюзов биолюминесцентной системы. В качестве линкеров, соединяющих домены между собой, был протестирован непроцессируемый GS-богатый линкер, который ранее показал свою эффективность при создании слитных белков (Chen, Zaro, and Shen 2013). Были протестированы процессируемые линкеры, расщепление которых приводит к высвобождению индивидуальных активных ферментов: 2А-пептиды (Sun et al. 2017) или IRES-элементы (Chan et al. 2011).
Комбинации генов и соединяющих их линкеров были получены методом модульного клонирования (MoClo) по технологии Golden Gate (Weber et al. 2011), основанной на стандартизированной сборке составных частей — промоторов, кодирующих последовательностей, терминаторов и других элементов (Level 0) — в транскрипционные единицы (Level 1). В качестве регуляторных элементов для всех вариантов были использованы конститутивный p35S промотор и терминатор tOCS. Был использован p35S промотор для обеспечения высокого уровня экспрессии в клетках растений (Shakhova et al. 2022). Последовательности полученных плазмид полностью соответствовали теоретическим последовательностям, что было подтверждено секвенированием по Сэнгеру.
3. Для создания триггер-активируемого биосенсора была создана плазмида, кодирующая компактную биолюминесцентную систему, помещенную под контроль триггер-активируемого промотора. Триггером являлось экзогенное применение фитогормона или исследуемых гербицидов, которое вызывало транскрипцию гена-фьюза и возникновение люминесценции. Был отобран триггер-активируемый промотор для создания компактной биолюминесцентной системы с триггер-активируемой экспрессией. Плазмиды с триггер-активируемой компактной биолюминесцентной системой были получены с помощью модульного клонирования по технологии Golden Gate (Weber et al. 2011). Была собрана триггер-активируемая транскрипционная единица с кодирующей последовательностью компактной биолюминесцентной системы. Для создания триггер-активируемой транскрипционной единицы были использованы векторы набора MoClo (Weber et al. 2011). В качестве промотора должен был использован pARR6 – триггер-активируемый промотор, отобранный иностранной научной группой и полученный методом полимеразной цепной реакции. Последовательности полученных плазмид полностью соответствовали теоретическим последовательностям, что было подтверждено секвенированием по Сэнгеру.
Была оценена функциональность полученных плазмид путем временной экспрессии в клетках растений и регистрации испускаемой ими люминесценции. Разработанные технологические решения по сборке триггер-активируемого биосенсора были экспериментально проверены иностранным партнером.
4. Было проведено патентное исследование на тему проекта в соответствии ГОСТ Р 15.011-2022 «Система разработки и постановки продукции на производство. Патентные исследования. Содержание и порядок проведения». Был проведен поиск и анализ патентной документации, относящейся к технологиям создания светящихся растений с использованием генов-фьюзов и принципам их работы. Все задачи 1 этапа работ выполнены в установленные сроки в соответствии с планом-графиком исследований Соглашения №075-15-2023-610 о предоставлении субсидии от 30 августа 2023 г.
Chan, Hsiao Yun, Sivakamasundari V, Xing Xing, Petra Kraus, Sook Peng Yap, Patricia Ng, Siew Lan Lim, and Thomas Lufkin. 2011. “Comparison of IRES and F2A-Based Locus-Specific Multicistronic Expression in Stable Mouse Lines.” PloS One 6 (12): e28885.
Chen, Xiaoying, Jennica L. Zaro, and Wei-Chiang Shen. 2013. “Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality.” Advanced Drug Delivery Reviews 65 (10): 1357–69.
Kotlobay, Alexey A., Karen S. Sarkisyan, Yuliana A. Mokrushina, Marina Marcet-Houben, Ekaterina O. Serebrovskaya, Nadezhda M. Markina, Louisa Gonzalez Somermeyer, et al. 2018. “Genetically Encodable Bioluminescent System from Fungi.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 115 (50): 12728–32.
Shakhova, Ekaterina S., Nadezhda M. Markina, Tatiana Mitiouchkina, Evgenia N. Bugaeva, Tatiana A. Karataeva, Kseniia A. Palkina, Liliia I. Fakhranurova, Ilia V. Yampolsky, Karen S. Sarkisyan, and Alexander S. Mishin. 2022. “Systematic Comparison of Plant Promoters in Nicotiana Spp. Expression Systems.” International Journal of Molecular Sciences 23 (23). https://doi.org/10.3390/ijms232315441.
Sun, He, Ni Zhou, Hai Wang, Dafang Huang, and Zhihong Lang. 2017. “Processing and Targeting of Proteins Derived from Polyprotein with 2A and LP4/2A as Peptide Linkers in a Maize Expression System.” PloS One 12 (3): e0174804.
Weber, Ernst, Carola Engler, Ramona Gruetzner, Stefan Werner, and Sylvestre Marillonnet. 2011. “A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs.” PloS One 6 (2). https://doi.org/10.1371/journal.pone.0016765.
2 июля