Проект направлен на определение функциональных участков люциферазы грибов путем создания библиотек инсерционных и делеционных вариантов фермента и анализа их активности в клетках дрожжей и растений. Биоимиджинг — совокупность методов для неинвазивного изучения и визуализации биологических процессов в тканях и клетках. Основные инструменты биоимиджинга до сих пор в основном представлены флуоресцентными репортерами, которые, хоть и являются чаще всего генетически кодируемыми, обладают рядом недостатков. Так, для их возбуждения необходимо внешнее облучение, что сопряжено с нежелательными, вызванными светом физиологическими эффектами на исследуемые клетки и фотообесцвечиванием репортеров. В случае растений, флуоресцентный биоимиджинг затруднен высокой пигментацией и автофлуоресценцией растительных тканей, а также высоким уровнем фона используемых репортеров (Pawley 2010). Альтернативой флуоресцентным являются инструменты, основанные на биолюминесценции — способности живых организмов излучать видимый свет. В ее основе лежит реакция окисления субстрата люциферина ферментом люциферазой. Люминесценция практически не имеет фона и не требует возбуждения внешним светом. В основе большинства самых широко применяемых люминесцентных инструментов лежит использование пар люциферин-люцифераза (Kaskova, Tsarkova, and Yampolsky 2016). Причем для большинства не были расшифрованы пути биосинтеза люциферинов, что делает их непригодными для неинвазивного биоимиджинга: необходимо внешнее добавление субстрата к исследуемым клеткам и тканям. В связи с чем на сегодняшний день люминесцентные инструменты для проведения биоимиджинга как в растениях, так и в дрожжах и млекопитающих, уступают флуоресцентным. Ранее нашей научной группой была охарактеризована биолюминесцентная система высших грибов: была определена структура люциферина, представляющего собой 3-гидроксигиспидин, найден ген люциферазы, а также расшифрован путь биосинтеза люциферина (Kotlobay et al. 2018). Это делает данный метаболический путь одним из лишь двух доступных на сегодняшний день генетически кодируемых биолюминесцентных систем и избавляет от необходимости добавлять субстрат люминесцентной реакции извне при проведении экспериментов по визуализации. При этом важно отметить, что структура и свойства ферментов этой системы до сих пор не были охарактеризованы. Это справедливо и для основного участника биолюминесцентной реакции — люциферазы. До сих пор не была расшифрована ее пространственная структура, не определен активный центр и механизм катализа окисления люциферина (3-гидроксигиспидина). Известно, что люцифераза содержит трансмембранный домен (Kotlobay et al. 2018). Это затрудняет как очистку рекомбинантного белка, так и предсказание активности фьюзов люциферазы с различными функциональными группами. В большинстве существующих биолюминесцентных инструментов люциферазы выступают в качестве основы для создания сенсоров (Yeh and Ai 2019): они катализируют реакцию окисления, в связи с чем, наряду с доступностью субстрата, от их активности и количества зависит общий выход света. Однако создание сенсоров на основе люциферазы грибов в настоящий момент затруднено: не известны участки в структуре люциферазы, отвечающие за ее активность, а также сайты для инсерции функциональных групп — других белков (например, флуоресцентных, в случае основанных на биолюминесцентном резонансном переносе энергии (BRET) сенсоров) или лиганд-связывающимх доменов (вторичных мессенджеров, сигнальных молекул и других), являющихся необходимой составляющей большинства индикаторов. Таким образом, целью настоящего проекта является изучение связи между структурой и функцией люциферазы грибов путем создания библиотек инсерционных и делеционных вариантов фермента и анализа их активности в клетках дрожжей и растений. Это создаст предпосылки для создания генетически кодируемых люминесцентных инструментов на основе люциферазы грибов для проведения неинвазивного биоимиджинга.