Одним из важных признаков раковых клеток является способность уходить от апоптоза, индуцируемого лекарственными средствами. При этом увеличивается устойчивость клеток как к обычной противоопухолевой терапии, например, химиотерапии, лучевой терапии, так и к таргетным терапевтическим препаратам. Преодоление устойчивости путем реактивации апоптоза является основным направлением поиска перспективных способов лечения рака. Эффективная индукция апоптоза с использованием новых терапевтических препаратов может быть ключевой стратегией предотвращения рецидивов и метастазов. Создание лекарств в данной области является непростой задачей, поскольку процесс апоптоза осложняется разнообразными механизмами резистентности и многогранной связью с перекрестными молекулярными путями. Основные направления разработки последних десятилетий - молекулы, ингибирующие антиапоптотические и усиливающие проапоптотические пути. Для успешного внедрения новых молекул необходимы исследования фундаментальных механизмов возникновения резистентности и тщательный дизайн инновационных препаратов. Лиганды суперсемейства фактора некроза опухолей (TNF) являются эффективными индукторами апоптотической гибели клеток, что делает их перспективными агентами для терапии рака и аутоиммунных заболеваний. TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) является членом суперсемейства TNF, который вызывает избирательную гибель опухолевых клеток, связываясь с рецепторами смерти DR4 и DR5 и индуцируя апоптоз. Для таргетной терапии злокачественных опухолей были разработаны различные рекомбинантные формы TRAIL, включая его рецептор-специфичные варианты, а также агонистические моноклональные антитела к рецепторам DR4 и DR5. Несмотря на то, что многие из этих средств продемонстрировали значительную противоопухолевую активность в доклинических исследованиях, их терапевтический эффект в клинических испытаниях был ограничен. Для усиления апоптотического сигнала в настоящее время разрабатываются новые молекулы TRAIL следующего поколения в виде гибридных белков, повышающих кластеризацию рецепторов смерти и усиливающих индукцию апоптоза. Нами был впервые получен уникальный мутантный вариант цитокина TRAIL DR5-B, который связывается с рецептором смерти DR5 так же эффективно, как TRAIL дикого типа, но практически не связывается с рецептором смерти DR4 и рецепторами-ловушками DcR1, DcR2 и OPG, блокирующими TRAIL-индуцированный апоптоз. Наши эксперименты показали, что DR5-B в разы эффективнее индуцирует гибель опухолевых клеток по сравнению с исходным TRAIL в большинстве линий опухолевых клеток как отдельно, так и при комбинированном воздействии c химиопрепаратами доксорубицином, бортезомибом, паклитакселом, цисплатином и панобиностатом. Кроме того, DR5-B не проявил цитотоксичности по отношению к нетрансформированным клеткам. На ксенографтных мышиных моделях колоректальной карциномы было показано, что DR5-B в 2,5-3 раза эффективнее ингибирует рост опухолей по сравнению с TRAIL дикого типа. Целью данного проекта является получение новых таргетных препаратов с повышенными противоопухолевыми свойствами на основе рецептор-специфичного варианта противоопухолевого цитокина TRAIL DR5-B. Планируется получение гибридного белка с пептидом, специфичным к рецептору фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), а также с пептидом iRGD, специфичным к рецептору нейропилин NRP-1. NRP-1 служит ко-рецептором рецептора VEGFR и играет важную роль в опухолевом ангиогенезе. Содержание VEGFR и NRP-1 в быстрорастущих опухолях значительно выше, чем в окружающих тканях, что может дополнительно повысить эффективность противоопухолевой терапии гибридными белками. Циклический пептид iRGD включает мотив Arg-Gly-Asp (RGD) и имеет высокую способность к связыванию с интегринами αvβ3 и αvβ5 в опухолевых сосудах и во внесосудистой паренхиме опухоли. Расщепленная форма iRGD, связываясь с NRP-1, запускает NRP-1-зависимый эндоцитоз, что приводит к усиленному проникновению в опухоль. Кроме того, iRGD демонстрирует низкую токсичность для нормальных клеток. Для достижения цели проекта планируется получить три варианта гибридных белков: DR5-B с VEGFR-специфичным пептидом HRH (HRHTKQRHTALH) на N-конце; DR5-B с пептидом iRGD на С- конце; и третий вариант гибридного белка с обоими пептидами на N- и С- концах. Предполагается, что получение гибридных белков с аффинностью к нескольким опухолевым мишенями позволит преодолеть резистентность клеток к DR5-B и расширить применение препаратов на основе DR5-B в терапии неопластических заболеваний. Гибридные белки HRH-DR5-B, DR5-B-iRGD и HRH-DR5-B-iRGD будут получены путем бактериальной экспрессии и очищены методами аффинной и ионообменной хроматографии. Будут исследованы физико-химические свойства препаратов. Будут определены степень тримеризации молекул и константы диссоциации с рецепторами DR5, VEGFR1, VEGFR2 для белка HRH-DR5-B, с рецепторами DR5 и интегринами для белка DR5-B-iRGD, а в случае гибридного белка HRH-DR5-B-iRGD со всеми указанными рецепторами. Будет проведен сравнительный анализ цитотоксической активности полученных гибридных белков с DR5-B в 2D- и 3D- системах опухолевых клеток различного происхождения. Планируется определить степень интернализации рецепторов DR5 и NRP-1 при связывании с гибридными белками на опухолевых клеточных линиях и накопление гибридных белков в 3D in vitro моделях на основе опухолевых клеточных сфероидов. Для всех полученных гибридных белков будут исследованы ключевые элементы DR5-опосредованного апоптотического сигналинга, включая активацию каспазы 8 и протеолиз PARP, а также механизмы лиганд-опосредованного внутриклеточного транспорта рецептора DR5. На финальном этапе работы планируется исследовать противоопухолевые свойства полученных гибридных белков на ксенографтных моделях опухолей колоректального рака человека (HCT116 и HT-29) в иммунодефицитных мышах. Для этого гибридные белки будут очищены в препаративных количествах и, по определенным нами ранее схемам, будут вводиться внутривенно в организм животных. Будет проведен сравнительный анализ торможения роста опухолей и выживаемости животных под воздействием DR5-B и полученных на его основе новых гибридных белков. Наиболее эффективный вариант препарата будет рекомендован для дальнейших доклинических и клинических исследований как новое эффективное средство для таргетной терапии опухолей.