В лаборатории развиваются взаимосвязанные направления научных исследований в области адаптивной эпигенетики, генно-инженерной экспериментальной биологии растений, создания искусственных ассоциативных систем «растение-микроорганизм» и приложения полученных результатов к разработке новых технологий.

Лаборатория проводит совместные исследования с коллегами из лабораторий Института и из других отечественных и зарубежных научных центров. Для изучения экспрессии искусственного гена антимикробного пептида цекропина Р1 в растениях и исследования свойств растений совместно с Группой химии пептидов, Лабораторией иммунохимии и Лабораторией биологических испытаний синтезированы различные формы антимикробного пептида цекропина Р1, получены его антитела и проведены испытания экстракта цекропиновых растений в экспериментах на животных. С Лабораторией иммунохимии также проведено исследование иммуногенных свойств растений картофеля, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В. С Учебно-научным центром ИБХ ведется работа по получению и исследованию трансгенных растений, экспрессирующих ген антимикробного пептида ареницина. Лаборатория сотрудничает и имеет совместные публикации с Институтом белка РАН, Институтом биохимии им А.Н. Баха РАН и Институтом физиологии растений РАН, Институтом физиологии растений РАН, ГУ Республиканским научно-практическим центром трансфузиологии и медицинских биотехнологий (Минск), Калифорнийским университетом (Дэвис), Невадским университетом (Nevada, Reno).

Лаборатория биотехнологии растений была основана в ФИБХ в 1992 году.

Адаптивная эпигенетика

Установлено, что в условиях адаптации факультативных галофитных растений Mesembryanthemum crystallinum к солевому стрессу и водному дефициту, сопровождающейся переключением С-3 фотосинтеза на CAM путь ассимиляции углекислого газа, уровень CpHpG метилирования (H – любой нуклеозид, кроме G) их ядерного генома в последовательностях CCWGG (W = A или T) повышается в два раза и связан с гиперметилированием повторяющихся последовательностей ДНК. Таким образом, впервые обнаружено специфическое CpNpG гиперметилирование повторяющихся последовательностей ДНК в условиях экспрессии новой эпигенетической программы. Функциональная роль CpNpG гиперметилирования ДНК, по-видимому, связана с формированием специализированной структуры хроматина, одновременно регулирующей экспрессию множества генов в клетках растений Mesembryanthemum crystallinum при их адаптации к солевому стрессу.

Установлено, что искусственный ген цекропина Р1 участвует в интегральной адаптивной системе растений. Растения с цекропином проявляли устойчивость к разным стрессам, в том числе солевому стрессу, ультрафиолету, окислительному стрессу. Таким образом, ген цекропина Р1 в трансгенных растениях выполняет функцию антистрессового гена. Исследованы трансгенные растения, экспрессирующие ген цекропина под контролем промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (35S) и селективный маркерный ген неомицинфосфотрансферазы II (nptII) под контролем промотора агробактериального гена нопалинсинтазы (nos). Проведено сравнение экспрессии и метилирования промоторов 35S и nos, а также биосинтеза цекропина Р1 трансгенных растений в условиях их роста на среде с канамицином и без канамицина. Метилирование активного промотора 35S отличается низким уровнем, при этом в условиях культивирования растений на среде с канамицином наблюдается дальнейшее снижение его метилирования и повышение синтеза цекропина Р1. Таким образом, активность считающегося конститутивным промотора 35S в трансгенных растениях контролируется его метилированием. Полученные результаты указывают на участие генов cecP1 и nptII в интегрированной системе стрессоустойчивости растений и показывают, что с помощью специфических условий культивирования можно регулировать синтез трансгенных антимикробных пептидов в растениях.

В лаборатории разработаны новые методы применения ДНК-метилтрансфераз в качестве реагентов в молекулярной биологии и структурно-функциональном исследовании энзиматического метилирования ДНК различных организмов. Разработан метод анализа метилирования в ДНК в последовательностях CpWpG. Проведено экзогенное метилирование генома животных и растений гетерологичными цитозиновыми ДНК-метилтрансферазами. Для направленного переноса  гетерологичных ДНК-метилтрансфераз в ядро эукариотических клеток в лаборатории была созданы специальные векторные конструкции.

В клетках культуры HEK 293 экспрессированы гены гетерологичных ДНК-метилтрансфераз со специфичностью CpHpG; обнаружена связь между этим метилированием генома трансформированных клеток и снижением их пролиферации. Обнаружено влияние экзогенного метилирования генома растений на их фенотип.

Генно-инженерная экспериментальная биологии растений

Лаборатория проводит исследования на полученных трансгенных растениях картофеля, капусты, сахарной свеклы, томата, масличных культурах рапса и камелины, чечевицы, лекарственных растениях каланхоэ и алоэ. В них, в частности, экспрессированы гены антимикробных пептидов. Растения с  этими генами проявляли устойчивость к бактериальным и грибным патогенам. Растения рода Kalanchoe давно используются в качестве лекарственных растений в народной медицине и представляют большой интерес для фармакологии. Сок растений Kalanchoe pinnata применяют для заживлению ран, ожогов, он обладает бактерицидными свойствами. Из этого растения получают лекарственные препараты для применения в хирургической, зубоврачебной, гинекологической практике и при лечении глазных  заболеваний. В Лаборатории исследован экстракт из трансгенных растений каланхоэ, экспрессирующих ген антимикробного пептида цекропина Р1. Антибиотические свойства экстракта сохраняются при выдерживании его при кипячении. Экстракт, добавленный в среду для культивирования растений, усиливает ризогенез каллусов трудных для морфогенеза растений хрустальной травки (Mesembryanthemum crystallinum). Повышенная биологическая активность экстракта обнаружена также в экспериментах на животных по его ранозаживляющим, бактерицидным и иммуномодулирующим свойствам. Полученные результаты указывают на высокую биологическую активность исследованного экстракта растений каланхоэ и перспективность его использования в фармакологии. Получены трансгенные растения табака, картофеля и томата, синтезирующие поверхностный антиген вируса гепатита В. В экспериментах на животных была показана высокая иммуногенность съедобного картофеля содержащего поверхностный антиген вируса гепатита В, что указывает на перспективность получения на основе таких растений съедобной вакцины. В своих исследованиях Лаборатория давно широко использует стратегию антисмысловых РНК (РНК-интерференции). На основе антисмысловых форм агробактериальных фитогормональных генов получены трансгенные растения, устойчивые к агробактериальному раку.

Большинство трансгенных растений экспрессируют нежелательные и даже опасные селективные гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам. Они используются для выявления трансформированных растений, но после этого они не нужны, но продолжают работать, затрачивая на себя энергию и метаболиты, снижая продуктивность растений. Передача этих генов микрофлоре и сорнякам опасна распространением множественной лекарственной устойчивости среди патогенов и появлением “суперсорняков”. В экспериментальной биологии присутствие этих генов делает невозможным проведение чистых экспериментов только с целевым трансгеном. Но уже возможно получение растений нового поколения без этих генов. В Лаборатории разработан новый метод получения безмаркерных трансгенных растений. Для этого был сконструирован агробактериальный безмаркерный вектор для встройки целевых генов и трансформации и выявления трансформантов на неселективных средах. Метод получения безмаркерных трансгенных растений по прямой детекции продукта экспрессии гена  позволяет в одну стадию выявлять трансгенные растения. У полученных растений изначально нет селективных генов, которые требуется дополнительно вырезать в других трудоемких методах создания безмаркерных трансгенных растений. Трансформанты не подвергаются селективному стрессу, вызывающему гиперметилирование ДНК и «замолкание» целевых генов. В геноме трансформантов меньше «генетического мусора».

С помощью этого метода ускорен процесс получения растений с целевым геном и возможены прямой отбор линий с высоким уровнем экспрессии трансгена и  проведение «чистых» экспериментов только с целевым трансгеном. Полученные таким методом

растения должны иметь более высокую продуктивность и конкурентное преимущество при коммерциализации.

Создание искусственных ассоциативных систем «растение-микроорганизм»

Применение традиционных микробиологических препаратов защиты растений и стимуляции их роста не всегда приводит к положительным результатам. Это связано с применением таких микроорганизмов, которые, будучи антагонистами фитопатогенов, не являются активными колонизаторами растений, устанавливающими с ними продуктивную ассоциативную связь. Это может быть также связано с трудностью образования стабильной ассоциативной связи между микроорганизмами и растениями, растущими в окружающей среде и уже «заселенными» неблагоприятной микрофлорой. В Лаборатории проводятся разработки новых технологий защиты с-х растений от фитопатогенов и чужеродных соединений путем создания искусственных ассоциативных систем «растение-микроорганизм». В работе применяется комплексное исследование колонизированных растений полезными природными и модифицированными штаммами микроорганизмов, устанавливающими стабильную ассоциативную связь с растениями. Полезные ассоциированные микроорганизмы оказывают стимулирующее влияние на растения за счет способности к азотфиксации, образованию физиологически активных веществ, мобилизации питательных элементов из почвы, вытеснению и подавлению роста патогенов, а также могут способствовать защите растений от токсичных ксенобиотиков.

Получение искусственных ассоциативных систем «растение-микроорганизм» направлено для решения двух основных задач:

• повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и их устойчивости к фитопатогенам
• повышения устойчивости растений к токсичным чужеродным соединениям.

Проводится поиск и отбор полезных ассоциативных микроорганизмов и разработка новых методов колонизации полезной микрофлорой овощных, масличных и плодово-ягодных культур растений. Для колонизации растений используются природные и модифицированные ассоциативные штаммы бактерий, дрожжей и арбускулярных микоризных грибов. Начальные стадии деградации токсичных соединений в системе «растение-микроорганизм» основаны на энзиматическом потенциале микроорганизмов, в то время как последующая трансформация этих продуктов и их полная утилизация в виде естественных метаболитов осуществляется ферментами растений и микроорганизмов. Для формирования устойчивых ассоциативных систем «растение-микроорганизм»  применяется разработанная в Лаборатории технология комбинированного использование методов клонального микроразмножения и микробной колонизации растений.

В совместной работе с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН показано, что метилобактерии  и другие рост-стимулирующие бактерии легко образуют с растениями ассоциативную связь и стабильно ее сохраняют при клональном микроразмножении растений. Колонизированные растения отличаются улучшенными физиологическими характеристиками и проявляют повышенную устойчивость к фитопатогенам. Колонизация растений бактериями, устойчивыми к ксенобиотикам нафталину и глифосату, придавала эту устойчивость растениям. Таким образом, разработанные технологии должны способствовать повышению продуктивности растений и получению экологически чистой сельскохозяйственной продукции, а также применяться для ремедиации территорий, загрязненных токсичными соединениями.

Патенты

1. Захарченко Н.С., Кочетков В.В., Бурьянов Я.И., Боронин А.М. Способ защиты посадочного материала растений против заболеваний, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами. Патент № 2380886 от 10 февраля 2010 г.
2. Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Юхманова А.А., Пиголева С.В., Рукавцова Е.Б., Чеботарева Е.Н., Гаязова А.Р. Рекомбинантная плазмида pBMи способ получения с ее
использованием безмаркерных трансгенных растений, синтезирующих целевые продукты. Патент №. 2410433 от 27 января 2011 г.
3. Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Лебедева А.А., Захарченко А.В., Сизова О.И., Анохина Т.О., Сиунова Т.В.,Кочетков В.В., Боронин А.М. Способ получения растительно-микробных ассоциаций для фиторемедиации на основе микроразмножаемых растений и плазмидосодержащих ризосферных бактерий. Патент № 2443771 от 27 февраля 2012 г.
4. Захарченко Н.С., Лебедева А.А., Бурьянов Я.И. Способ получения генетически модифицированных растений каланхоэ, экспрессирующих ген цекропина Р1. Патент № 2445768 от 27 марта 2012 г.

5. Захарченко Н.С., Лебедева А.А., Бурьянов Я.И. Способ получения безмаркерных трансгенных растений каланхоэ перистого, экспрессирующих ген цекропина Р1. Патент №
2624042 от 30 июня 2017 г.
6. Бурьянов Я.И., Лебедева А.А., Захарченко Н.С. Способ получения безмаркерных трансгенных растений каланхоэ перистого, экспрессирующих ген цекропина Р1. Заявка №
2015154311 от 17.12.2015.
7. Захарченко Н.С., Бурьянов Я.И. Способ получения антимикробного пептида цекропина Р1 из экстракта трансгенных растений каланхоэ перистого. Заявка № 2016133605 от 16.08.2016.

Научные проекты

Загрузка...

Захарченко Наталья Сергеевна

Пущино (Моск. обл.), проспект Науки, 6 — На карте