В ходе выполнения проекта в 2016-2018 г. решалась задача выхода на новые пептиды, которые сами бы оказались лекарствам или расширяли бы возможности конструирования новых лекарств на основе пептидов или пептидомиметиков. Направленность проекта отражена в его названии: определенная группа белков семейства Ly6 (распространенных в самых разнообразных организмах, в том числе в мозге и иммунной системе человека) взаимодействуют с различными подтипами никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (нАХР), которые в свою очередь участвуют в мышечном сокращении, умственной деятельности, воспалительных и иных процессах. Все Ly6 белки имеют ту же трех-петельную пространственную структуру, что и α-нейротоксины из ядов змей (блокирующие некоторые подтипы нейрональных и мышечных нАХР), при этом такие белки как Lynx1 прикреплены гликозилфосфатидилинозитольным якорем к мембране вблизи нАХР, а такие как SLURP1 этого якоря не имеют и являются секретируемыми. Поскольку в литературе имеются данные о благоприятном модулирующем действии упомянутых белков при различных заболеваниях (в том числе и онкологических), создание на их основе пептидных препаратов (значительно более простых в производстве) представляет несомненный интерес. Планирование получения фрагментов таких белков (в том числе и с более жесткой пространственной структурой) представлялось оправданным, поскольку ранее на сходных фрагментах трех-петельных токсинов змей удавалось получить желаемую активность. В этом же проекте были и пептиды Conus. Дело в том, что яды различных видов морских моллюсков Conus содержат библиотеки пептидов, действующих на разнообразные ионные каналы и рецепторы. В частности, мишенями α-конотоксинов являются различные подтипы мышечных и нейрональных нАХР; при этом ни один другой класс антагонистов не имеет такую высокую избирательность к какому-либо определенному подтипу нАХР, как α-конотоксины. Таким образом, нАХР являются общими мишенями для ряда Ly6 белков и α-конотоксинов. Поскольку в нашем отделе имелся богатый опыт работы с Ly6 белками и α-конотоксинами (включая рентгеноструктурный анализ α-конотоксинов различной специфичности в комплексах с ацетилхолин-связывающим белком, прекрасно моделирующим лиганд-связывающие домены не только никотиновых, но и остальных Cys-петельных рецепторов), в выполнявшемся проекте исследования нАХР проводились с использованием природных α-конотоксинов, их сконструированных более активных аналогов, а также синтетических фрагментов нескольких Ly6 белков, как отвечающих природной последовательности, так и имеющих более жесткую структуру, благодаря сближению N- и C-концов за счет добавленной дисульфидной связи (то есть, приближенных к структуре, имеющейся в α-конотоксинах). Главная задача Проекта 2016 была выполнена: при анализе взаимодействия с нейрональными никотиновыми рецепторами лигандов двух совершенно различных типов – Ly6 белков и α-конотоксинов - были синтезированы пептиды, включающие в себя фрагменты центральных петель нескольких таких белков, пространственная структура которых была сделана более жесткой включением дисульфидной связи, поскольку дисульфидные связи являются существенной характеристикой α-конотоксинов. Несомненным успехом можно считать то, что некоторые из этих пептидов имели ту же активность, что и исходные полноразмерные белки. Однако эта активность проявляется при довольно высоких концентрациях (в микромолярном диапазоне) и ни одно из полученных соединений не имеет ту высокую селективность по отношению к индивидуальному подтипу рецепторов, которая является основным достоинством α-конотоксинов. Именно повышение аффинности и селективности созданных соединений является главной задачей продолжения проекта. Поэтому в продолжающемся проекте основным моментом будет 1) установление пространственных структур синтезированных нами петель Ly6 белков - Lynx1 и SSS, а также анализ их конформационной подвижности. 2) Это позволит провести компьютерное моделирование их связывания с различными типами никотиновых рецепторов и их моделями и выбрать замены в аминокислотной последовательности, которые помогут повысить сродство этих соединений к их мишеням. 3) Выбранные пептидные соединения будут синтезированы, их строение и индивидуальность доказаны, затем будет испытана их токсичность в опытах in vitro (с помощью радиолигандного анализа, электрофизиологии и кальциевого имиджинга на природных и гетерологически экспрессированных рецепторах), а также in vivo на животных моделях. 4) Сходный подход будет использован для получения конотоксинов, имеющих более высокое сродство к определенным типам нАХР, в частности к альфа7 нАХР, вовлеченному в регуляцию воспалительных процессов в иммунной системе. Здесь же будут продолжены работы по кристаллизации комплексов с ацетилхолин-связывающими белками и лиганд-связывающими доменами нАХР. 5) Завершением работы с положительно заряженными антагонистами нАХР будет синтез новых олигоаргининовых антагонистов, в том числе соединений с введенными ароматическими и иными аминокислотными остатками, а также полимерных вариантов. 6) Хотя заявленной темой проекта были пептиды, но поскольку в нашем отдел в последнее время, наряду с нейротоксическими белками и пептидами исследуются и низкомолекулярные соединения, а исследования проводятся совместно на большом наборе рецепторов, в ходе проекта мы также изучали аналоги 6-бромгипафорина, агониста альфа7 нАХР. Так как результаты оказались близки к заявленной итоговой теме проекта – выход на лекарственные соединения - будут завершены работы по сконструированным аналогам, проведенный анализ которых показал их перспективность в подавлении воспалительных процессов. Это означает их синтез в препаративных количествах и подготовку доклинических испытаний. В целом, как для выполненного Проекта 2016, так и для его предлагаемого продолжения характерны несомненная новизна (впервые синтезированы фрагменты Ly6, не уступающие по активности полноразмерным белкам) и актуальность - влияние на активность индивидуальных подтипов никотиновых рецепторов, являющихся мишенями, для создания анальгетиков и ряда иных лекарственных средств.