Разработка новых молекулярных инструментов ферментативного и флуорогенного флуоресцентного мечения для прижизненной визуализации в живых системах
Технологии современной флуоресцентной микроскопии позволили достичь беспрецедентного уровня понимания многих биологических процессов и вошли в арсенал ключевых инструментов современной биологии и молекулярной медицины. Использование подобных технологий невозможно без введения в исследуемые объекты различных меток, в роли которых могут выступать флуоресцентные белки, а также синтетические флуорофоры. К сожалению, все существующие подходы не лишены недостатков, поэтому создание новых эффективных методов флуоресцентного мечения живых систем является актуальной и важной задачей. В связи с этим, целью настоящего исследования является разработка новых молекулярных инструментов визуализации процессов, протекающих в живых системах. В рамках поставленной цели в проекте планируется реализовать три ключевых направления: 1) Расширение палитры красителей, пригодных для использования в системе флуоресцентного мечения с использованием мутантных форм лигазы липоевой кислоты. В природе эта лигаза катализирует ковалентное связывание липоевой кислоты с определенным пептидным фрагментом. Синтетические мутанты этого фермента могут аналогичным образом катализировать реакцию с флуоресцентными красителями, что может быть использовано для пострансляционного мечения белков, если в них добавлена нужная последовательность аминокислот. К сожалению, на данный момент создано лишь две мутантные формы этой лигазы, которые позволяют вводить синюю и красную флуоресцентные метки. В нашей работе мы планируем расширить этот набор за счет создания новых красителей с похожей структурой и тестирования их против масштабной библиотеки мутантных форм лигазы с измененным сусбтрат-связывающим «карманом». 2) Создание новых пар флуороген/флуороген-активирующий белок на основе хромофоров флуоресцентных белков и белков NanoLuc и Y-FAST. Помимо традиционных подходов к мечению, в которых используются объекты, имеющие постоянную флуоресценцию, недавно был разработан ряд методов основанных на использовании веществ–флуорогенов, которые не имеют выраженной флуоресценции сами по себе, однако приобретают ее при связывании с целевыми белками. Одной из перспективных групп веществ-флуорогенов являются производные хромофоров флуоресцентных белков, характеризующиеся колоссальным химическим разнообразием и широчайшей палитрой цветов. В настоящем проекте мы планируем протестировать возможность активации флуоресценции этих веществ белками NanoLuc и Y-FAST, чьи субстраты имеют очень похожее строение. Использование комбинаторной библиотеки веществ и проведение нескольких итерационных шагов тестирование-анализ-синтез-тестирование позволят добиться нужного результата. 3) Создание новых специфических низкомолекулярных сенсоров, обладающих выраженной флуорогенностью. Третьей частью настоящего проекта станет создание генетически не кодируемых меток. В роли подобных меток чаще всего используются различные сенсоры – флуорофоры, в структуре которых содержится группа чувствительная к определнному аналиту. Основной проблемой, которая возникает при использовании подобных веществ, является нецелевое мечение и наличие фонового сигнала. В настоящей работе мы предлагаем видоизменить этот подход и использовать в роли сенсоров вещетсва с выраженной флуорогенностью – упомянутые производные хромофоров флуоресцентных белков. Такие сенсоры не будут флуоресцентны в воде, а будут флуоресцировать лишь в менее полярных средах. Подобное свойство не позволит наблюдать мгновенного отклика на появление аналитов в водной среде, однако позволит избежать размывания и позволит детектировать аналиты в мембранах. Более того, эти вещества смогут стать отличными красителями, селективными в отношении отдельных органелл клеток, богатых определенными аналитами (окислителями, кислотами, тиолами и т.п.), так как накопление флуоресцентного сигнала будет происходить строго в мембранах подобных органелл. Таким образом, реализация настоящего проекта позволит предложить новые подходы к визуализации процессов, протекающих в живых системах, с помощью генетически кодируемых и некодируемых технологий флуоресцентного мечения с использованием новых флуоресцентных и флуорогенных соединений. Подобные результаты позволят достигнуть прорыва в решении задач многоцветного флуоресцентного мечения, а также визуализации быстродеградирующих белков и других актуальных направлениях, что является важной задачей, не только в фундаментальном, но и в прикладном плане.
1 Июля 2018 года 30 Июня 2023 года
Список публикаций по проекту
- (2020). Ultrafast excited-state proton transfer dynamics in dihalogenated non-fluorescent and fluorescent GFP chromophores. J Chem Phys 152 (2), 021101
- (2019). Enamine–azide [2+3]-cycloaddition as a method to introduce functional groups into fluorescent dyes. Tetrahedron Lett 60 (5), 456–459
- (2021). Styrene Derivatives of Indole and Pyranone as Fluorogenic Substrates for FAST Protein. Russ. J. Bioorganic Chem. 47 (1), 334–337
- (2021). A novel dialkylamino gfp chromophore as an environment-polarity sensor reveals the role of twisted intramolecular charge transfer. Chemosensors (Basel) 9 (8),
- (2021). Excited-State Dynamics of a meta-Dimethylamino Locked GFP Chromophore as a Fluorescence Turn-on Water Sensor. Photochem Photobiol 98 (2), 311–324
- (2021). Conformationally Locked 5-Benzylidene-4H-Imidazolthion as a Fluorogenic Dye. Russ. J. Bioorganic Chem. 47 (6), pages1352–1355
- (2022). Environment-sensitive fluorogens based on a GFP chromophore structural motif. Dyes Pigm 198, 110033
- (2021). NanoFAST: structure-based design of a small fluorogen-activating protein with only 98 amino acids. Chem Sci 12 (19), 6719–6725
- (2021). Probing gfp chromophore analogs as anti-hiv agents targeting ltr-iii g-quadruplex. Biomolecules 11 (10),
- (2022). Study of the Position of the Conjugated Substitute Influence on the Optical Properties of the Kaede Protein Chromophore Derivatives. Russ. J. Bioorganic Chem. 48 (3), 651–654
- (2022). Structure-based rational design of an enhanced fluorogen-activating protein for fluorogens based on GFP chromophore. Commun Biol 5 (1), 706
- (2022). Spatial Structure of NanoFAST in the Apo State and in Complex with its Fluorogen HBR-DOM2. Int J Mol Sci 23 (19),
- (2022). Synthesis and Optical Properties of the Conformationally Locked Diarylmethene Derivative of the GFP Chromophore. Russ. J. Bioorganic Chem. 48 (48), 1101–1104
- (2022). Halogen-Containing 4-Hydroxybenzylidene-Rhodanines as Fast Protein Fluorogens. Russ. J. Bioorganic Chem. 48 (48), 1105–1108
- (2022). CycloOctaTetraene as a Photostabilizer of Fast Protein Fluorogen. Russ. J. Bioorganic Chem. 48 (6), 1362–1366
- (2019). Designing redder and brighter fluorophores by synergistic tuning of ground and excited states. Chem Commun (Camb) 55 (17), 2537–2540
- (2019). Photoinduced Proton Transfer of GFP-Inspired Fluorescent Superphotoacids: Principles and Design. J Phys Chem B 123 (17), 3804–3821
- (2019). Pyridine analogue of fluorescent protein chromophore: Fluorogenic dye suitable for mitochondria staining. Dyes Pigm 170,
- (2019). Red-shifted substrates for FAST fluorogen-activating protein based on the GFP-like chromophores. Chemistry 25 (41), 9592–9596
- (2022). Fluorescence Modulation of ortho-Green Fluorescent Protein Chromophores Following Ultrafast Proton Transfer in Solution. J Phys Chem B 126 (27), 5081–5093