Модифицированные нуклеозиды составляют большую группу синтетических препаратов и проявляют широкий спектр биологической активности. Среди них известны препараты первого выбора для терапии в клинике онкогематологических заболеваний человека (кладрибин, неларабин, флудара, цитарабин), а также вирусных инфекций (азидотимидин, марибавир, рибавирин, видарабин, софосбувир, ислатравир). В фокусе современных исследований – проблема создания новых высокоэффективных соединений, обладающих высокой селективностью и пониженной системной токсичностью для организма человека. Направления модификации касаются изменения структуры гетероциклического основания и углеводного фрагмента молекулы. Наиболее современный подход – синтез предшественников фармпрепаратов с запрограммированной устойчивостью к клеточным ферментам, осуществляющим быстрый катаболизм модифицированного нуклеозида. В последние два десятилетия активно развивался комплексный химико-ферментативный подход к синтезу модифицированных нуклеозидов. В случае моноферментативных реакций вместо химического гликозилирования используется стерео- и региоселективное ферментативное трансгликозилирование. В качестве биокатализатора широко применяются ферменты нуклеинового обмена – бактериальные нуклеозидфосфорилазы (пуринового и пиримидинового типа) или рибозил(дезоксирибозил)трансферазы, осуществляющие реакцию трансгикозилирования. Суть этого подхода – в переносе природного или модифицированного углеводного фрагмента на модифицированное или природное гетероциклическое основание. Преимущество использования биокатализа – высокая стерео- и региоселективность, доступность биокатализатора, очень мягкие условия синтеза нуклеозидов в водных буферных растворах. Из-за отсутствия сложных примесей – простые способы выделения продуктов из реакционных смесей. Несомненным преимуществом реакции ферментативного трансгликозилирования является возможность синтеза из одного модифицированного основания нескольких нуклеозидов с различными углеводными остатками и, напротив, имея источник модифицированного углеводного фрагмента, можно переносить на него разнообразные основания, в том числе и неприродного типа. Используя данный подход можно создавать библиотеки новых нуклеозидов для тестирования биологической активности. Второй подход в синтезе новых нуклеозидов и нуклеотидов – использование полиферментных каскадов, позволяющих осуществлять превращение субстрата от самого элементарного (например, рибозы) до модифицированных нуклеозидов или нуклеотидов. Так для синтеза нуклеозидов используется тройной каскад ферментов: рибокиназа ―> фосфопентомутаза ―> нуклеозидфосфорилаза. В случае получения нуклеотида: рибокиназа ―> 5-фосфо-рибозил-1-пирофосфатсинтетаза―>фосфорибозилтрансфераза. Принципиальные схемы моно и полиферментных каскадных реакций приведены в дополнительном файле. Первый каскад адаптирован к синтезу рибозидов, 2-дезоксирибозидов и арабинозидов. Второй можно использовать при получении только рибозидов и дезоксирибозидов. Ферменты, осуществляющие перенос гетероциклических оснований на заключительной стадии каскадов обладают довольно широкой субстратной специфичностью. Максимально толерантным к структуре переносимых гетероциклических оснований является пуриннуклеозидфосфорилаза E. coli (PNP). Несмотря на то, что нами была решена 3-D структура фермента с разрешением 0.9 А границы применимости ферментативного подхода к синтезу новых модифицированных нуклеозидов четко не определены. Наши экспериментальные данные, опубликованные за последние годы, значительно расширяют представления о функциональности и субстратной специфичности PNP E. coli. Синтезы многих новых соединений проходили с использованием оснований, которые (по литературным данным) не должны были оказаться субстратами для фермента. Тем не менее, нами с помощью ферментов получены новые нуклеозиды, которые до сих пор не были синтезированы классическими химическими способами. В настоящее время мы проводим цикл работ по расширению репертуара синтетических гетероциклических оснований – перспективных субстратов нуклеозидфосфорилаз. Мы доказали, что фермент способен акцептировать основания, которые только отдаленно напоминают структуру природного пурина. Несмотря на то, что ферменту «предлагались» основания, содержащие полициклические (в том числе – трициклические гетероциклические) ароматические системы, фермент оказался способен позиционировать в своем активном центре субстрат таким образом, что реакция биосинтеза нуклеозида протекала с достаточной эффективностью, но немного медленнее, чем в случае с природным основанием. Мы считаем, что можно значительно расширить структурный ассортимент гетероцикличсеких оснований - акцепторов углеводных остатков в синтезе новых нуклеозидов, обладающих противовирусной или противоопухолевой активностью. Для нуклеозидфосфорилаз E. coli возможности переноса углеводных остатков не ограничены только рибозой и 2-дезоксирибозой (в отличие от трансфераз). Очень эффективно проходят синтезы нуклеозидов – производных 2,3-дидезоксирибозы, арабинозы, 2-фторарабинозы, 3-амино-3-дезоксирибозы, 3-дезоксирибозы, а также фторированных по 2 или 3 положению соединений дезоксирибозы. В итоге, для каждого нового основания можно осуществить биосинтез минимум 6 нуклеозидов как с природными, так и с неприродными углеводными остатками. Недавно нами получены первые данные, что для некоторых оснований, которые не являются субстратами для PNP возможен синтез нуклеотидов с помощью фосфорибозилтранфераз E. coli (aдениновой (APRT) и гипоксантин-гуаниновой (HGPRT)). Так, например, возможен биосинтез 5'-монофосфата рибозида фавипиравира (2-гидроксипиразин-3-карбоксамида, T-705). Интерес к фавипиравиру значительно возрос в связи с возможностью его использования в качестве противовирусного средства для лечения инфекций, вызванных опасными вирусами Эболы и COVID-19. Механизм действия фавипиравира установлен, однако использование его в клинике ограничено высокой системной токсичностью препарата. Действующим препаратом является 5’-трифосфат рибозида фавипиравира. Но рибозилированию в клетках in vivo подвергается только один из смеси изомеров T-705, составляющих основу препарата. Фактичеcкая двойная дозовая нагрузка очень тяжело переносится возрастными пациентами, составляющими основную группу летальности от вируса COVID-19. По этой причине применение в клинике фавипиравира сильно ограничено. Использование ферментов нуклеинового обмена в синтезе нуклеозидов фавипиравира позволит быстро получить новые нуклеозиды и нуклеотиды фавипиравира и его структурных аналогов, что очень важно при создании новых антивирусных соединений. Глобальная задача проекта – создание новых модифицированных нуклеозидов с измененными гетероциклическими основаниями и углеводными остатками, структура которых будет далека от природных. Эти нуклеозиды должны быть запрограммированы на запуск новых метаболических процессов в организме in vivo. Из-за многообразия ферментов нуклеинового обмена, метаболических и катаболических возможностей ферментативных систем человека определить in silico четко и однозначно мишень для действия нового препарата очень сложно. Часто только осуществление практического синтеза новых соединений и проведение изучения их биологической активности помогает выявить максимально активные соединения. Крайне интересным и важным является направление экспериментальных работ по созданию модифицированных ферментов с точечными одиночными и множественными мутациями в структуре активного центра. Для этих целей будет использоваться комплексный подход с привлечением возможностей компьютерного моделирования взаимодействия активного центра фермента с неприродными субстратами. Цель создания мутантных форм ферментов – изменение и расширение субстратной специфичности ферментов и, как результат, применимости метода биосинтеза при получении новых нуклеозидов и нуклеотидов, структура которых далека от природных. Планируется получение мутантных форм пурин- и пиримидиновой фосфорилаз, гуанин-гипоксантиновой фосфорибозилтрансферазы. Таким образом, цель настоящего проекта – всестороннее развитие химико-ферментативного подхода к синтезу новых модифицированных нуклеозидов и нуклеотидов для получения серии соединений с неприродными гетероциклическими основаниями. Изучение их противоопухолевой и антивирусной активности в экспериментах In vitro. Использование полученных в рамках реализации проекта результатов позволит выявить активные соединения и в дальнейшем целенаправленно создавать новые селективные противовирусные и противоопухолевые препараты для терапии социально-опасных заболеваний человека.