Пресс-центр / новости / Наука /
О чем могут рассказать бактериальные пептиды в сыворотки крови человека?
Может ли анализ крови человека рассказать о составе его кишечной бактериальной микрофлоры? Сотрудники лаборатории Протеомики Института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН уверены, что может – об этом свидетельствует их недавняя работа «Бактериальные пептиды в сыворотки крови». Результаты этого исследования были представлены Г. П. Арапиди на X Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии».
Количество клеток микроорганизмов, обитающих в кишечнике на порядок превышает количество клеток самого человеческого организма – согласно подсчетам, в нашем организме клетки людей составляют всего 10 процентов от общего количества. Таким образом, вклад микробиоты в деятельность организма человека нельзя недооценивать – хотя бы потому, что суммарный геном симбиотических микроорганизмов в сто раз превышает таковой человека. Согласно данным европейских групп исследователей, в популяции людей существует 3 энтеротипа микробиот, то есть 3 отличающихся по составу бактериальных сообщества, которые весьма устойчивы.
Соотношение клеток микробов и клеток человеческого организма
В основном различи между энтеротипами связывают с группами бактерий Bacteroides, Prevotella, Ruminococcus. Разница энтератипов формируется как следствие особенностей метаболизма микроорганизмов, входящих в сообщество, так и наличия различных пищевых ниш, которые занимают эти энтеротипы – последнее обуславливается особенностями питания разных групп людей.
Разные энтеротипы микробиоты
Поскольку симбиотические микроорганизмы живут в сообществе, то они совместно реагируют на различные внешние раздражители. И реагировать им есть на что – как показано в одной из ранних работ группы Джеффри Гордона, состав микробиоты кишечника может изменяться в ответ на воздействие внешнего фактора – в данном случае, на изменение диеты. Эти же авторы нашли различия в метаболизме симбиотических представителей групп Firmicutes и Bacteroides – по мнению исследователей, эти отличия объяснили успешность двух типов диет.
Следует заметить, что в настоящее время известно достаточно много работ, авторы которых исследуют корреляцию состава микробиоты и изменения воздействия на организм каких-либо внешних или внутренних факторов. Таковыми могут являться изменения энергетического обмена, воздействие каких-либо заболеваний желудочно-кишечного тракта или химиотерапия. В то же время изменения видового состава микроорганизмов кишечника оказывают сильное влияние на разные процессы, происходящие в организме их хозяев – так, исследования, проведенное на мышах и крысах показали, что изменение состава микробиоты могут даже влиять на такой процесс, как обучаемость.
Группа исследователей из лаборатории Протеомики ИБХ РАН в состав которой входили Г. П.Арапиди, Р. Х.Зиганшин, О. М.Иванова, М. С.Осетрова, П. В.Павлович, Т. М.Савельева, В. О.Шендер, С. И.Ковальчук, Н. А.Аниканов, В. М.Говорун, В. Т.Иванов решила изучить воздействие химиотерапии (ХТ) на микробиоту кишечника человека. В исследовании также принимали участие сотрудники Федерального научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева (ФНКЦ ДГОИ), предоставившие для работы коллекции образцов сыворотки крови от пациентов с лейкемией (а также дававшие необходимые медицинские консультации), а также ученые из НИИ физико-химической медицины (ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА), которые проводили масс-спектрометрические анализы.
Авторы исследования
Сначала исследователи взяли образцы сыворотки крови у шести здоровых доноров и десяти человек, которые были больны лейкемией. В последнем случае сыворотка бралась у пациентов на разных этапах полихимиотерапии: до начала лечения, через 7 дней, а также после курса ХТ, то есть через 14 дней. Полученные образцы анализировали следующим образом: сначала их фракционировали на магнитных микрочастицах с катионообменной поверхностью, затем проводили термическую десорбцию пептидно-белковых комплексов по методике, которая была разработана в Лаборатории протеомики ИБХ РАН. Полученные элюаты исследовали при помощи масс-спекрометрии, а потом проводился подробный биоинформатический анализ. Последнему уделялось много внимания, поскольку исследователи искали в сыворотке крови то, что до них практически никто не изучал.
Идентификация пептидов сыворотки крови
Одной из основных направлений работы было использование объединенной базы данных (БД) состоящей из баз всех известных белковых последовательностей человека по версии UniProtKB и БД всех известных белковых последовательностей микробиоты кишечника человека по версии NCBI. Использование объединенной БД позволило исследователям «калиброваться» на идентификации, которые проводились по БД белков человека, поскольку никто не будет сомневаться, что в человеческой крови несомненно, должны присутствовать пептиды этих белков. Такая «калибровка» помогла точно идентифицировать пептиды белков микробиоты.
Примером такой калибровки может служить зависимости времени хроматографического выхода от относительной гидрофобности пептидов (см иллюстрацию). Эта зависимость рассчитывалась с использование алгоритмов, опубликованных коллегами в статье: «Predicting Peptide Retention times for Proteomics». По вертикальной оси отложено время выхода того или иного идентифицированного пептида с хроматографа (это данные масс-спектрометрии), а по горизонтальной – относительная гидрофобность этих же пептидов. Синие точки на графике соответствуют пептидам, идентифицированным как фрагменты белков человека, оранжевые точки – пептиды, интерпретированные поисковыми алгоритмами как фрагменты белков микробиоты кишечника.
Линейная зависимость, которая указана как черная линия, строилась на основании только данных о пептидах человека. Достаточно строгим критерием правильной идентификации является попадание пептида в 10 минутный интервал относительно зависимости (который представлен двумя зелеными линиями). Точки, которые в интервал не попали, прежде всего оранжевые, пептиды микробиоты кишечника, считались неверно идентифицированными. Именно так и происходила «калибровка» по пептидам человека, необходимая для точной идентификации пептидов микроорганизмов в крови человека.
Диаграмма зависимости времени выхода от относительной гидрофобности пептидов
Исследователи также разработали алгоритм «msBLAST», являющийся аналогом известного алгоритма BLAST, который используется при нахождении гомологичных белков. У классической версии этого алгоритма есть несколько серьёзных недостатков: в частности, данная программа использует метод локального выравнивания, что связано с наличием в различных белках сходных доменов и паттернов. Однако, когда это применяется для идентификации пептидов, то возникают многочисленные ошибки, поскольку данные последовательности куда короче белковых. Кроме того, известно, что такие аминокислоты, как лейцин и изолейцин совершенно неразличимы при использовании масс-спектрометрии. Классическая версия BLAST этого не учитывает, а msBLAST настроен на то, чтобы искать все возможные совпадения запрашиваемой пептидной последовательности с учетом возможных замен лейцина на изолейцин и наоборот.
Таким образом, Г.П. Арапиди и его коллеги использовали алгоритм “msBLAST” для поиска пептидных последовательностей, которые поисковый алгоритм отнес к белкам миробиоты, против БД последовательностей всех белков человека. При этом исследователи «позволяли» пептиду иметь до одной любой аминокислотной замены. Это связано с тем, что БД белков человека основана на геноме одного или группы людей, а те пациенты у которых забирали кровь, были совсем другими людьми, и, следовательно, их геномы могли отличаться от таковых людей, чьи белки были представлены в базе. Авторы работы предположили, что эти отличия могут выражаться как однонуклеотидный полиморфизм, который потенциально может приводить к единичным заменам аминокислот. То есть весь список пептидов, который был идентифицирован против БД белков человека, был еще раз проверен с учетом возможности замены одной аминокислоты.
На заключительно стадией идентификации был проведен синтез аналогов «опознанных» пептидов микробиоты. Далее проводилось масс-спектрометрический анализ этих синтетических аналогов и сравнение результатов с таковыми пептидов, обнаруженных в сыворотке крови. И если масс-спектры совпадали, то исследователи делали вывод о правильности идентификации пептида. Таким способом была проведена проверка для 10 пептидов из сыворотки крови, что подтвердило справедливость их идентификации как пептидов микробиоты.
В итоге Г. Арапиди и его коллеги смогли идентифицировать 4128 уникальных пептидов, относящихся к белкам человека и 272 уникальных пептида, являющихся фрагментами белков микробиоты кишечника. Таким образом было выяснено, что пептиды микробиоты в сыворотке крови человека составляют от 2 до 5 процентов от общего количества идентифицированных белков. Что касается количества пептидов в крови пациентов, находящихся на разных стадиях лечения лейкоза посредством ХТ, то было замечено, что в их крови пептидов было значительно меньше по сравнению со здоровыми донорами. Так, у последних процентное доля пептидов микробиоты равнялась 4,8 процентам, у больных лейкемией до начала ХТ она была ниже, 3,6 процента, у тех, кто проходил курс ХТ семь дней, доля микробных пептидов снижалась до 2,5 процентов, а у пациентов после курса ХТ она была еще ниже - 2,3 процента.
Общее количество идентифицированных пептидов
Кроме того, было подсчитано количество уникальных идентифицированных спектров пептидов, поскольку число таких спектров на пептид тоже является количественным показателем представленности тех или иных пептидов. И если для человеческих пептидов в среднем идентифицируется от 12 до 15 спектров на каждый пептид, то для микробиоты этот показатель не превышает трех спектров на пептид. Это прежде всего говорит о том, что в сыворотке крови человека очень мало пептидов микроорганизмов.
Все идентифицированные пептиды относились к тем или иным белкам различных представителей микробиоты кишечника. Это позволило оценить видовое разнообразие кишечной микрофлоры у тех людей, чья сыворотка крови была исследована –как здоровых доноров, так и больных лейкемией. Исследователи выяснили, что разнообразие микроорганизмов резко падает примерно в 3 раза на 7 день после начала курса химиотерапии. Подобное снижение разнообразие было отмечено для каждого пациента. По данным исследователей, под воздействием ХТ уменьшалось количество видов микроорганизмов из групп Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Actinobacteria, хотя на фоне падения разнообразия Proteobacteria и Firmicutes таковое представителей группы Bacteroidetes показывало относительный рост. Это объясняется тем, что у здоровых доноров разнообразие представителей групп Proteobacteria и Firmicutes было исходно выше.
Распределение типов микроорганизмов кишечника
Исходя из этого, исследователи сделали вывод о том, что полихимиотерапия может оказывать сильное воздействие на состав микробиоты кишечника. Интересно, что весьма похожая ситуация была описана другим научным коллективом в статье «Differential effects of antibiotic therapy on the structure and function of human gut microbiota». Авторы данной работы изучили влияние комплексной ХТ на клеточное деление, синтез белков, синтез клеточной стенки у представителей различных групп кишечной микробиоты человека. В результате они выяснили, что при прохождении курса ХТ у пациентов происходило значительное уменьшение разнообразия и количества представителей группы Firmicutes, незначительно - Proteobacteria, и в тоже время наблюдался относительный рост Bacteroidetes. По мнению авторов работы, это происходило потому, что что во время химиотерапии пациентам давали препарат из группы аминогликозидов, который угнетает синтез белка, а также препарат из группы карабапенемов - он тормозит синтез пептидогликанов клеточной стенки. Таким образом, результаты этих исследований хорошо коррелируют с таковыми, полученными Г.П. Арапиди и его коллегами.
Влияние химиотерапии на состав микробиоты
Исследователи считают, что их работа имеет большую практическую ценность – получается, что по наличию тех или иных пептидов в сыворотке крови можно определить присутствие конкретного микроорганизма в кишечнике человека. И хотя вопрос о том, насколько корректно проводить диагностику микробиоты по сыворотки крови, остается пока что предметом дискуссий, однако данная работа показала, что подобный способ диагностики вполне возможен.
Литература:
1. M. Arumugam et al. «Enterotypes of the human gut microbiome». Nature 473, 174-180 (2011)
2. Ley, R. E., et al. (2006) «Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity». Nature 444(7122): 1022-1023.
3. Krokhin OV, Spicer V. «Predicting Peptide Retention times for Proteomics». Curr Protoc Bioinformatics. 2010; Chapter 13: Unit 13.14.
4. Perez-Cobas, A. E., et al. (2013) «Differential effects of antibiotic therapy on the structure and function of human gut microbiota». PLoS One 8(11): e80201.
19 ноября 2015 года
