Пресс-центр / новости / Наука /

Основные научные достижения Института в 2013 году

18 декабря 2013 г. в Институте состоялось заседание Ученого совета, на котором были рассмотрены итоги выполнения НИР в уходящем году. Ниже приведены краткие аннотации научных достижений, представленные руководителями подразделений (все материалы приведены в авторской редакции).

Чугунов А.О.

Лаборатории молекулярной иммунологии и молекулярной биофизики — платформа для разработки многофункциональных наноструктур и инструментария для их регистрации

Разработка включает наносистемы для адресной доставки агентов для диагностики и терапии на основе нано- и микрочастиц, содержащих распознающие, визуализующие и лекарственые агенты, и инструментарий для получения 3-D распределения и 3-D структуры наносистем и их идентификации с использованием комплекса нанотехнологических методов, включающих атомно-силовую микроскопию, оптическую микроспектроскопию и нанотомографию.

Впервые с помощью белок-опосредованной нековалентной самосборки получены коллоидные бифункциональные (флуоресцентные и магнитные) нано- и микрочастицы, обладающие исключительной устойчивостью к экстремальным для белков денатурирующим условиям. Разрабатываемая технология белок-опосредованной нековалентной самосборки мультифункциональных коллоидных нано- и микрочастиц предназначена для создания нового поколения тера(г)ностических агентов.

Совместно с Институтом трансплантологии и искусственных органов им. В.И. Шумакова и НИЯУ «МИФИ» создан новый подход, основанный на объединении трех наноинструментальных методов: сканирующей зондовой микроскопии, оптической микроспектроскопии и ультратомографии. Экспериментальная реализация нового подхода является прообразом нового класса инструментов, позволяющих получать информацию о структурных и оптических свойствах нано- и микрочастиц и их распределения в биологических объектах.

Разработана технология получения мультифункциональных надмолекулярных комплексов на основе нано- и микро-суперструктур путем самосборки функциональных модулей различной природы с помощью различных молекулярных адаптеров, базирующихся на белок-белковых взаимодействиях (барназа/барстар; стрептавидин/конъюгат биотина с антителами; антитело/антиген; белок А/IgA). Впервые путем такой белок-опосредованной самосборки полистирольных микро- и наночастиц двух типов получены бифункциональные, одновременно магнитные и флуоресцентные, коллоидные микро- и наноконструкции. Проведено детальное исследование их устойчивости в широком диапазоне условий: рН, температура, ионная сила, присутствие хаотропных агентов, ультразвуковое воздействие. Продемонстрировано, что системы нековалентной самосборки, в которых участвуют гибридные функциональные элементы — конъюгаты коллоидных частиц с белками, необычно стабильны и выдерживают экстремальные для молекул белков денатурирующие условия. Сравнение системы барназа—барстар с другими системами самосборки на основе белок-белковых взаимодействий показало ее значительное преимущество при сборке надмолекулярных структур в жестких условиях

Созданный новый подход основан на объединении трех наноинструментальных методов: сканирующей зондовой микроскопии, оптической микроспектроскопии и ультратомографии. Метод позволяет реконструировать трехмерное изображение образца неограниченной толщины с высоким пространственным разрешением (нанометровый диапазон) и получать спектрально-оптические данные от локальных областей образца. Экспериментальная реализация нового подхода является прообразом нового класса инструментов, позволяющих получать информацию о структурных и оптических свойствах локальных областей нанометрового диапазона, нано- и микро- суперструктур, их распределении в локальных областях биологических объектов.

В целом, разработанный взаимно дополняющий комплекс из нового типа нано-, микроструктур и макроинструментов для их регистрации, идентификации и анализа, позволяет сделать новый шаг в изучении свойств наноразмерных объектов и материалов: наноструктурированных поверхностей, нанокомпозитов, наночастиц, биологических и медицинских объектов.

  1. Aghayeva U.F., Nikitin M.P., Lukash S.V., Deyev S.M. (2013). Denaturation-resistant bifunctional colloidal superstructures assembled via the proteinaceous barnase-barstar interface. ACS Nano 7, 950–961;
  2. Mochalov K.E., Efimov, A.E., Bobrovsky A., Agapov, I.I., Chistyakov A.A., Oleinikov V., Sukhanova A., Nabiev I. (2013). Combined Scanning Probe Nanotomography and Optical Microspectroscopy: A Correlative Technique for 3D Characterization of Nanomaterials. ACS Nano 7, 8953–8962;
  3. Generalova A.N., Sizova S.V., Zdobnova T.A., Zarifullina M.M., Artemyev M.V., Baranov A.V., Oleinikov V.A., Zubov V.P., Deyev S.M. Submicron polymer particles containing fluorescent semiconductor nanocrystals CdSe/ZnS for bioassays. Nanomedicine 6, 195–209.

Отдел биоинженерии — исследования и пространственная структура новой формы бактериородопсина

Cовместно c лабораторией биомолекулярной ЯМР спектроскопии, а также с участием кафедры биофизики Биологического факультета МГУ, Отдела физиологии и биофизики Университета Калифорнии, Ирвайн, и Института структурной биологии, Гренобль.

Проведены структурно-функциональные исследования и расшифрована пространственная структура бактериородопсина Exiguobacterium sibiricum — нового уникального представителя семейства ретиналь-содержащих белков, осуществляющих трансмембранный перенос протонов.

Проведено клонирование гена бактериородопсина Exiguobacterium sibiricum (ESR), разработаны система его функциональной продукции в мембране клеток Escherichia coli и бесклеточная система экспрессии в присутствии различных мембраномоделирующих сред. Проведено изучение фотоцикла ESR и его мутантных вариантов. Установлено, что донором протонов для основания Шиффа в молекуле ESR является остаток лизина Lys 96, а протон-акцепторный участок включает сопряженные остатки His57 и Asp85. Методом рентгеноструктурного анализа c разрешением 2.3 Å расшифрована пространственная структура ESR — первая в мире пространственная структура ретиналь-содержащего белка эубактерий, не содержащего дополнительного хромофора. Обнаружено нарушение α-спиральной структуры в сегменте F, включающее 310 и π-спиральные элементы. Эта особенность предположительно является характерной для протеородопсинов, что позволяет использовать полученную структуру в качестве модели для изучения других белков семейства.

  1. Balashov S.P., Petrovskaya L.E., Imasheva E.S., Lukashev E.P., Dioumaev A.K., Wang J.M., Sychev S.V., Dolgikh D.A., Rubin A.B., Kirpichnikov M.P., Lanyi J.K. B(2013). Breaking the Carboxyl Rule: Lysine-96 Facilitates Reprotonation of the Schiff Base in the Photocycle of a Retinal Protein from Exiguobacterium sibiricum. J. Biol. Chem. 288, 21254–21265;
  2. Dioumaev A.K., Petrovskaya L.E., Wang J., Balashov S.P., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Lanyi J.K. (2013). Photocycle of Exiguobacterium sibiricum Rhodopsin Characterized by Low-Temperature Trapping in the IR and Time-Resolved Studies in the Visible. J. Phys. Chem. B. 117, 7235–7253.
  3. Shenkarev Z.O., Lyukmanova E.N., Butenko I.O., Petrovskaya L.E., Paramonov A.S., Shulepko M.A., Nekrasova O.V., Kirpichnikov M.P., Arseniev A.S. (2013). Lipid-protein nanodiscs promote in vitro folding of transmembrane domains of multi-helical and multimeric membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1828, 776–784;
  4. Gushchin I., Chervakov P., Kuzmichev P., Popov A., Round E., Borshchevskiy V., Ishchenko A., Petrovskaya L., Chupin V., Dolgikh D., Arseniev A., Kirpichnikov M., Gordeliy V. (2013). Structural insights into the proton pumping by unusual proteorhodopsin from nonmarine bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 12631–12636.

Лабоpатоpия нейрорецепторов и нейрорегуляторов

Пептидный анальгетик, действующий на протонактивируемые каналы ASIC3

В нематоцистах морской актинии обнаружен уникальный пептидный анальгетик, проявляющий ингибирующую активность в отношении протонактивируемых каналов ASIC3.

Из нематоцистов актинии Urticina grebelnyi выделен пептид Ugr 9-1, вызывающий 100%-ингибирование быстрой компоненты, а также неполное подавление медленной компоненты токов через протонактивируемые ASIC3 каналы. Установлена структура пептида, содержащего 29 аминокислотных остатков, а также уникальная структура его гена-предшественника. Разработан способ получения рекомбинантного пептида Ugr 9-1 в бактериальной системе экспрессии. Методами ЯМР установлена уникальная пространственная структура рекомбинантного Ugr 9-1, представляющая собой «уплощенную» β-шпильку с пятью β-поворотами, стабилизированную 2 дисульфидными и 8 водородными связями. Биологическая активность Ugr 9-1 изучена в тестах на животных, основанных на измерении анальгетического эффекта при воспалительных реакциях, в которых немаловажный вклад в восприятие боли вносят ASIC3 каналы. Показано, что Ugr9-1 в дозах 0,1 и 0.5 мг/кг в значительной мере ослабляет тепловую гиперчувствительность, вызванную введением воспалительного агента, а также вызывает снижение ответа более чем на 40% в тесте кислотной стимуляции боли. Морфин, известный своими анальгетическими и наркотическими свойствами, демонстрировал в данных тестах схожие результаты в дозах 1–5 мг/кг. Таким образом, пептид Ugr 9-1 обладает обезболивающим эффектом при физиологически допустимых концентрациях, значения которых на порядок меньше, чем для известных обезболивающих препаратов, применяемых в медицинской практике.

  1. Osmakov D.I., Kozlov S.A., Andreev Y.A., Koshelev S.G., Sanamyan N.P., Sanamyan K.E., Dyachenko I.A., Bondarenko D.A., Murashev A.N., Mineev K.S., Arseniev A.S., Grishin E.V. (2013). Sea anemone peptide with uncommon β-hairpin structure inhibits acid-sensing ion channel 3 (ASIC3) and reveals analgesic activity. J. Biol. Chem. 288, 23116–23127.

Антифунгальные пептиды α-харпинины — члены нового семейства защитных пептидов растений

Установлены полноразмерные структуры кДНК, кодирующие антифунгальные пептиды семян пшеницы Кихара (Triticum kiharae) и звездчатки средней (Stellaria media), принадлежащих к новому семейству защитных пептидов растений — α-харпининов. Установлено участие N- и C-концевых участков пептида Sm-AMP-X семян звездчатки (S. media) в формирование вторичной структуры данного пептида, которая, в свою очередь, является одним из определяющих факторов, отвечающих за проявление его биологической активности.

В результате 3’- и 5’-RACE ПЦР были определены полноразмерные структуры кДНК α-харпининов семян пшеницы Кихара (Triticum kiharae) и звездчатки средней (Stellaria media), соответствующие белкам-предшественникам, содержащим в своем составе тандемные повторы последовательностей, кодирующих гомологи зрелых пептидов. Исследование структурно-функциональной взаимосвязи нового антифунгального α-харпинина из семян звездчатки средней (S. media) позволила доказать участие N- и C-концевых участков данной молекулы в формирование вторичной структуры, которая является одним из параметров, обеспечивающих реализацию функционального действия. Полученные научные результаты играют важную роль в исследовании молекулярных механизмов устойчивости культурных и дикорастущих растений к биотическим стрессовым факторам, а также могут быть использованы в прикладных исследованиях с целью повышения невосприимчивости сельскохозяйственных культур растений к грибным фитопатогенам.

  1. Utkina L.L., Andreev Y.A., Rogozhin E.A., Korostyleva T.V., Slavokhotova A.A., Oparin P.B., Vassilevski A.A., Grishin E.V., Egorov T.A., Odintsova T.I. (2013). Genes encoding 4-Cys antimicrobial peptides in wheat Triticum kiharae Dorof. et Migush.: multimodular structural organization, instraspecific variability, distribution and role in defence. FEBS J. 280, 3594–608;
  2. Slavokhotova A.A., Rogozhin E.A., Musolyamov A.K., Andreev Y.A., Oparin P.B., Berkut A.A., Vassilevski A.A., Egorov T.A., Grishin E.V., Odintsova T.I. (2014). Novel antifungal α-hairpinin peptide from Stellaria media seeds: structure, biosynthesis, gene structure and evolution. Plant Mol. Biol. 84,189—202.

«Модульные» токсины из яда пауков

В яде пауков обнаружены «модульные» токсины, состоящие из двух пептидных доменов. Каждый из модулей у таких токсинов соответствует «обычному» нейротоксину или цитотоксину. Встречаются токсины с любой из четырех возможных комбинаций модулей в составе одной полипептидной цепи. Выработка модульных токсинов — общее явление для ядовитых паукообразных, соответствующее эволюционному вектору «от простого к сложному».

Яды пауков — природные фармакопеи, состоящие из сотен биологически активных молекул, особое место среди которых занимают пептиды. Наиболее распространенными являются линейные катионные цитотоксины (ЦТ), а также цистеин-богатые нейротоксины (НТ). Две работы, опубликованные в этом году, завершают цикл, посвященный так называемым «модульным» токсинам пауков. Эти токсины построены из двух модулей или доменов, «сшитых» в одну полипептидную цепь. Каждый из модулей соответствует «обычному» однодоменному токсину — ЦТ или НТ. Примечательно, что в яде пауков встречаются все четыре возможных варианта: НТ-НТ, НТ-ЦТ, ЦТ-НТ и ЦТ-ЦТ. Предполагается, что модульные токсины возникли из белков-предшественников сложного типа, созревающих с образованием двух зрелых пептидов, в результате мутации мотивов процессинга. Такое усложнение — объединение двух структурных модулей в составе одной молекулы — привело к появлению у новых токсинов интересных функциональных особенностей. Например, двухмодульные токсины типа ЦТ-ЦТ приобрели высокую токсичность по отношению к насекомым, не характерную для изолированных доменов. Для токсинов типа НТ-ЦТ и ЦТ-НТ характерно мембрано-опосредованное связывание с мишенью (при этом ЦТ выступает как элемент, необходимый либо для первоначальной ассоциации с мембраной, либо для заякоривания в мембране уже после образования комплекса с белковым рецептором), а домены токсинов типа НТ-НТ проявляют синергию.

  1. Kuzmenkov A.I., Fedorova I.M., Vassilevski A.A., Grishin E.V. (2013). Cysteine-rich toxins from Lachesana tarabaevi spider venom with amphiphilic C-terminal segments. Biochim. Biophys. Acta 1828, 724–731;
  2. Vassilevski A.A., Sachkova M.Y., Ignatova A.A., Kozlov S.A., Feofanov A.V., Grishin E.V. (2013). Spider toxins comprising disulfide-rich and linear amphipathic domains: A new class of molecules identified in the lynx spider Oxyopes takobius. FEBS J. 280, 6247–6261.

Предыдущие работы из цикла:

  1. Vassilevski A.A., Kozlov S.A., Samsonova O.V., Egorova N.S., Karpunin D.V., Pluzhnikov K.A., Feofanov A.V., Grishin E.V. (2008). Cyto-insectotoxins, a novel class of cytolytic and insecticidal peptides. Biochem. J. 411, 687–696;
  2. Vassilevski A.A., Fedorova I.M., Maleeva E.E., Korolkova Y.V., Efimova S.S., Samsonova O.V., Schagina L.V., Feofanov A.V., Magazanik L.G., Grishin E.V. (2010). Novel class of spider toxin: Active principle from the yellow sac spider Cheiracanthium punctorium venom is a unique two-domain polypeptide. J. Biol. Chem. 285, 32293–32302.

Лабоpатоpия биомолекулярной ЯМР спектроскопии — пространственная структура и механизм активации рецептора фактора роста фибробластов FGFR3

На примере FGFR3 из семейства рецепторов факторов роста фибробластов проведен анализ белок-белок и белок-липид взаимодействий для ТМ домена, получена пространственная структура ТМ домена и исследованы конформационные изменения при его ассоциации. Предложен механизм активации FGFR3 в норме и при патологиях.

Одно из перспективных направлений в структурной биологии — исследования мембранных белков, в т.ч. изучение механизма функциональной димеризации битопных мембранных белков и конструирование активных веществ, для адекватной терапии социально-значимых заболеваний.

Получены 15N и 13C меченые препараты, соответствующие ТМ-домену белка рецепторной тирозинкиназы FGFR3. Установлена пространственная структура гомодимера FGFR3tm — симметричный димер с левой сверхспирализацией параллельных α-спиралей. Димер стабилизирован контактами Ван-дер-Ваальса между остатками Leu и Ile и стэкинг-взаимодействием Phe и Tyr. α-Спирали взаимодействуют по «семичленному» мотиву YA374X2L377X2G380X2FF384X2IL388X2A391X2TL395, на котором расположены 3 известные патогенные мутации Tyr373Cys (проонкоген), Gly380Arg (ахондроплазия), Ala391Glu (синдром Крузона, проонкоген). Альтернативный тандемный GG4-мотив A574X3S378X3G380, предсказанный молекулярным моделированием, предполагает правозакрученную ассоциацию ТМ спиралей FGFR3, аналогичную РТК ErbB в активном состоянии рецептора. Сопоставления с литературными данными показали, что, активация РТК семейства FGFR может происходить по вращательно-сцепленному механизму марионетки («string-puppet mechanism»).

Лабоpатоpия углеводов — способность галектинов узнавать молекулярные паттерны бактериальных полисахаридов

Галектины известны как белки, узнающие β-галактоза-терминированные углеводные цепи гликопротеинов и гликолипидов. С помощью микроэррэя, содержащего 150 бактериальных полисахаридов (ПС), мы показали, что галектины-4, −8 и −9 способны связываться с несколькими бактериальными ПС, структура которых приведена в Таблице.

Факт связывания этих галектинов с ПС из SalmonellaentericaO13 и из E. coliO86ab неудивителен, так как их структура почти идентична структуре гликанов системы групп крови АВН, с которыми галектины-4, −8 и −9 хорошо взаимодействуют на поверхности клетки (Е.М.Рапопорт и соавт., Glycobiology, 2012). В то же время, структура остальных трех ПС не имеет ничего общего ни с гликанами системы АВН, ни с β-галактозидами. Мы объясняем факт необычной специфичности галектинов тем, что они узнают в составе полисахаридов не линейные (как в случае относительно гибких гликанов в гликопротеинах и гликолипидах), а конформационно-сближенные участки витков спирали жестких ПС. Мы предполагаем, что в составе целых бактерий возможно узнавание галектинами молекулярных паттернов, составленных из соседних ПС цепей; если это подтвердится, то галектины становятся еще одним звеном врожденного противобактериального иммунитета.

  1. Knirel Y.A., Gabius H.-J., Blixt O., Rapoport E.M., Khasbiullina N.R., Shilova N.V., Bovin N.V. (2014). Humantandem-repeat-typegalectinsbindbacterialnon-β-Galpolysaccharides. Glycoconj. J. 31, 7–12.

Лаборатория химии липидов

Липосомы с липофильным пролекарством и тетрасахаридным лигандом селектинов SiaLeX направлены на эндотелий сосудов опухоли (совместно с лабораторией углеводов ИБХ РАН и Российским онкологическим научным центром им. Н.Н. Блохина РАМН)

Показано in vivo (на модели карциномы легких Льюис), что противоопухолевый эффект 100-нм липосом, сконструированных на основе природных фосфолипидов и липофильного пролекарства мелфалана, и несущих тетрасахаридный лиганд селектинов сиалил-Льюис Х (SiaLeX), обусловлен специфическим антиваскулярным эффектом в ткани опухоли. В отсутствие адресного лиганда липосомы накапливаются в опухолевой ткани за счет пассивного транспорта, в то время как введение углеводного конъюгата обеспечивает их активный транспорт к эндотелию опухолевых сосудов, вызывая специфическое повреждение последних.

  1. Kuznetsova N.R., Stepanova E.V., Peretolchina N.M., Khochenkov D.A., Boldyrev I.A., Bovin N.V., Vodovozova E.L. (2014). Targeting liposomes loaded with melphalan prodrug to tumour vasculature via the Sialyl Lewis X selectin ligand. J. Drug Target. doi: 10.3109/1061186X.2013.862805.

Открытие и функции нового липид-переносящего белка (совместно с университетами Миннесоты и Вирджинии США и др.)

С применением набора флуоресцентномеченых фосфо- и гликолипидов, в сотрудничестве с коллективом, возглавляемым проф. Р.Брауном (Институт им. Хормеля, США), исследованы функции вновь открытого церамид-1-фосфат-переносящего белка (C1P), широко распространенного в клетках тканей млекопитающих. Показано, что C1P модифицирует активность фосфолипазы А2 и тем опосредует биосинтез эйкозаноидов. Подробнее об этом рассказывается в пресс-релизе «Новый липид-переносящий белок CPTP и его флуоресцентный субстрат».

  1. Simanshu D.K., Kamlekar R.K., Wijesinghe D.S., Zou X., Zhai X., Mishra S.K., Molotkovsky J.G., Malinina L., Hinchcliffe E.H., Chalfant C.E., Brown R.E., Patel D.J. (2013). Nonvesicular trafficking of ceramide-1-phosphate by a lipid transfer protein that regulates eicosanoid production. Nature 500, 463–467.

Лабоpатоpия синтетических вакцин — активная иммунизация пептидом или введение противопептидных антител восстанавливает нейроны мозга

Изучено иммунопротективное действие пептидного фрагмента прионного белка 95-123 и антител к нему в экспериментальной модели болезни Альцгеймера. Показано, что иммунизация этим фрагментом мышей с нейродегенерацией альцгеймеровского типа, вызванной удалением обонятельных луковиц, предотвращает нарушение пространственной памяти животных и снижает уровень мозгового бета-амилоида. Иммунизация предохраняет гипокампальные и кортикальные нейроны от дегенерации, вызванной операцией бульбэктомии (на рисунке слева). Таким же протективным действием обладают аффинно очищенные противопептидные антитела. Введение животным антител приводит как к восстановлению пространственной памяти животных, так и к сохранению синтаптической плотности нейронов мозга, определенной по иммунодетекции синаптофизина (на рисунке справа). Полученные данные свидетельствуют о том, что иммунизация синтетическим фрагментом прионного белка может стать основой для разработки новых средств терапии и профилактики болезни Альцгеймера.

Лабоpатоpия биокатализа — антидот против фосфорорганических отравляющих веществ пролонгированного действия на основе рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека

В результате проведенных исследований удалось разработать эффективную систему экспрессии активной бутирилхолинэстеразы человека в клетках линии СНО. Использование промотора EF-1 позволило значительно увеличить продукцию рекомбинантного белка клетками — с 3–5 мг/л до 40 мг/л. Были проведены опыты по оптимизации химической модификации рекомбинантного антидота. В результате удалось создать долгоживущий в токе крови полисиалированный фермент с кинетическими параметрами идентичными исходной бутирилхолинэстеразе способный протектировать мышей от 4,7 летальных доз отравляющего вещества VR. При этом в физиологических тестах животные не проявляли какие-либо изменения в поведении.

  1. Ilyushin D.G., Smirnov I.V., Belogurov A.A. Jr., Dyachenko I.A., Zharmukhamedova T.Iu., Novozhilova T.I., Bychikhin E.A., Serebryakova M.V., Kharybin O.N., Murashev A.N., Anikienko K.A., Nikolaev E.N., Ponomarenko N.A., Genkin D.D., Blackburn G.M., Masson P., Gabibov A.G. (2013). Chemical polysialylation of human recombinant butyrylcholinesterase delivers a long-acting bioscavenger for nerve agents in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1243–1248.

Лабоpатоpия протеомики — пептидный пул клеток мха

В клетках модельного организма — мха Physcomitrella patens — идентифицированы свыше 28 тыс. эндогенных пептидов. На основе высокоточного масс-спектрометрического анализа впервые были продемонстрированы существенные различия между пептидомами протопластов, протонемы и гаметофоров, представленных несколькими тысячами уникальных пептидов. В протопластах мха в условиях стресса отмечены существенные изменения пептидома и транскриптома в сравнении с протонемой и гаметофорами.

  1. Tyakht A.V., Kostryukova E.S., Popenko A.S., Belenikin M.S., Pavlenko A.V., Larin A.K., Karpova I.Y., Selezneva O.V., Semashko T.A., Ospanova E.A., Babenko V.V., Maev I.V., Cheremushkin S.V., Kucheryavyy Y.A., Shcherbakov P.L., Grinevich V.B., Efimov O.I., Sas E.I., Abdulkhakov R.A., Abdulkhakov S.R., Lyalyukova E.A., Livzan M.A., Vlassov V.V., Sagdeev R.Z., Tsukanov V.V., Osipenko M.F., Kozlova I.V., Tkachev A.V., Sergienko V.I., Alexeev D.G., Govorun V.M. (2013). Human gut microbiota community structures in urban and rural populations in Russia. Nat. Commun. 4, 2469.

Лаборатория моделирования биомолекулярных систем

PREDDIMER —веб-сервер для предсказания пространственной структуры димеров трансмембранных спиралей белков.

Разработанный алгоритм предсказания димеров трансмембранных (ТМ) спиралей [1] реализован в виде веб-сервера PREDDIMER [2], доступного на сайте лаборатории: http://model.nmr.ru/preddimer. Сервер позволяет предсказывать набор конформаций гомо- и гетеродимеров на основании заданных последовательностей их ТМ спиралей, оценивать эффективность упаковки полученных димеров, а также визуально представлять результаты в виде трехмерных моделей структуры и двумерных карт распределения гидрофобных свойств на поверхности ТМ спиралей. Важной особенностью метода является его способность генерировать набор конформаций димеров, часть из которых может реализовываться в зависимости от функционального состояния белка и свойств мембранного окружения. Эффективность подхода продемонстрирована путем сравнения результатов предсказания с 11 известными ЯМР-моделями ТМ димеров.

Сервер использован для предсказания структуры ТМ димеров рецептора фактора роста тромбоцитов A (PDGFRA) дикого типа и онкогенного ТМ мутанта (V536E). Показано, что мутация модулирует упаковку ТМ димеров данного рецептора. Этот эффект, в свою очередь, может быть связан с повышенной базальной активностью (в отсутствие лиганда) у PDGFRA V536E [3]. Работа проведена в сотрудничестве с экспериментальной группой в Католическом университете Лёвена (Брюссель, Бельгия).

Подробнее об этом можно прочесть в пресс-релизе «In silico-предсказание трансмембранных димеров для битопных белков».

  1. Volynsky P.E., Polyansky A.A., Fakhrutdinova G.N., Bocharov E.V., Efremov R.G. (2013). Role of dimerization efficiency of transmembrane domains in activation of fibroblast growth factor receptor 3. J. Amer. Chem. Soc. 135, 8105–8108;
  2. Polyansky A.A., Chugunov A.O., Volynsky P.E., Krylov N.A., Nolde D.E., Efremov R.G. (2013). PREDDIMER: a web server for prediction of transmembrane helical dimers. Bioinformatics doi: 10.1093/bioinformatics/btt645;
  3. Velghe A.I., Van Cauwenberghe S., Polyansky A.A., Chand D., Montano-Almendras C.P., Charni S., Hallberg B., Essaghir A., Demoulin J.B. (2013). PDGFRA alterations in cancer: characterization of a gain-of-function V536E transmembrane mutant as well as loss-of-function and passenger mutations. Oncogene doi: 10.1038/onc.2013.218.

Модульная организация и основа селективного действия α-нейротоксинов из яда скорпионов (совместно с Лабораторией нейрорецепторов и нейрорегуляторов)

В Лаборатории моделирования биомолекулярных систем разработан оригинальный и эффективный в вычислительном отношении метод расчета и визуализации распределения физико-химических свойств белков на их поверхности — метод «Белковой топографии». Метод дает возможность проведения сравнительного количественного анализа свойств поверхностей для группы белков. С его помощью установлены молекулярные детерминанты селективного действия на потенциал-чувствительные натриевые каналы (ПЧНК) α-нейротоксинов из яда скорпионов, предложена модель модульной организации токсинов, согласно которой эти белки содержат модуль специфичности и «сердцевинный» модуль. Выдвинута гипотеза о том, что такое модульное строение отражает доменную структуру ПЧНК.

Найденная закономерность в строении α-нейротоксинов позволяет делать предсказания относительно активности неизвестных молекул из этой же группы, а также проводить рациональный дизайн пептидов с требуемой селективностью. Так, было предсказано, что α-нейротоксин BeM9 из яда скорпиона M. Eupeus должен обладать смешанной млеко/инсектотоксичностью, что и было подтверждено в биохимическом эксперименте на рекомбинантном токсине, полученном в Лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов.

Подробнее об этом можно прочесть в пресс-релизе «„Белковая топография“ объясняет селективное действие α-нейротоксинов из яда скорпионов».

  1. Chugunov A.O., Koromyslova A.D., Berkut A.A., Peigneur S., Tytgat J., Polyansky A.A., Pentkovsky V.M., Vassilevski A.A., Grishin E.V., Efremov R.G. (2013). Modular Organization of α-Toxins from Scorpion Venom Mirrors Domain Structure of Their Targets — Sodium Channels. J. Biol. Chem. 288, 19014–19027.

Лабоpатоpия молекулярных основ эмбриогенеза — способность к регенерации низших позвоночных и белок Ag1

Впервые установлено, что секретируемые белки семейства Ag1 присутствуют только у низших позвоночных (рыбы, амфибии), но отсутствуют у высших (рептилии, птицы, млекопитающие).

Впервые установлено, что секретируемые белки семейства Ag1 присутствуют только у низших позвоночных (рыбы, амфибии), но отсутствуют у высших (рептилии, птицы, млекопитающие). При этом, на модели головастиков шпорцевой лягушки нами было показано, что гены Ag1 активируются в клетках регенерационной бластемы при регенерации хвоста и задней конечности. Учитывая эти данные, а также литературные данные других авторов об участии гомологов Ag1 — белков Agr2 — в регуляции регенерации конечностей у тритона, мы выдвинули гипотезу о том, что утрата высшими позвоночными способности к регенерации больших придатков тела могла быть связана с потерей их предками генов семейства Ag1.

  1. Ivanova A.S., Tereshina M.V., Ermakova G.V., Belousov V.V. Zaraisky A.G. (2013). Agr genes, missing in amniotes, are involved in the body appendages regeneration in frog tadpoles. Sci. Rep. 3, 1279.

Лабоpатоpия сравнительной и функциональной геномики — репертуары Т-клеточных рецепторов для группы монозиготных близнецов и адаптивный иммунитет

Впервые выполнен глубокий сравнительный анализ индивидуальных репертуаров Т-клеточных рецепторов (ТКР) для группы монозиготных близнецов и определен вклад генетических факторов в формирование адаптивного иммунитета человека.

С использованием оригинальной стратегии получения, широкомасштабного секвенирования и специализированного биоинформатического анализа репрезентативных библиотек кДНК α- и β-ТКР реконструированы индивидуальные репертуары периферических Т-лимфоцитов для четырех пар монозиготных близнецов и проведен исчерпывающий сравнительный анализ полученных репертуаров. Установлено, что а) Т-клеточные репертуары близнецовых пар не отличаются от пар неродственных индивидов по числу совпадений в клональном разнообразии общего пула Т-лимфоцитов б) функционально активная часть репертуаров у монозиготных близнецов значительно обогащена идентичными по структуре антиген-распознающих участков α- и β-ТКР (CDR3-участки) клонами Т-лимфоцитов; такие Т-клеточные клоны равновысоко представлены в индивидуальных репертуарах каждого из пары близнецов, в) часть идентичных для близнецовой пары Т-клонов несет зрелые гены ТКР с синонимичными заменами в нуклеотидной последовательности CDR3-участков, что свидетельствует о независимом образовании, но сходной селекции в тимусе и пост-тимусной клональной экспансии у монозиготных близнецов, г) генетическая идентичность близнецовой пары определяет предпочтительный выбор конкретных групп V-сегментов при сборке генов β-ТКР и своеобразие тимусной селекции Т-клонов при подборе зрелых генов α-ТКР. Полученные результаты существенно обогащают современные представления о вкладе генетических факторов в ключевые этапы процесса формирования адаптивного иммунитета человека.

Лабоpатоpия биофотоники — флуоресцентные красители на основе структуры природного хромофора зеленого флуоресцентного белка

Синтезированы флуоресцентные красители на основе структуры природного хромофора зеленого флуоресцентного белка GFP. Отличительными особенностями нового класса флуорофоров являются высокая водорастворимость, высокая химическая стабильность в физиологических условиях, низкая молекулярная масса, высокая яркость флуоресценции.

Это позволило применить полученные флуорофоры в качестве эффективных и удобных флуоресцентных меток. Так, с помощью разработанного нами флуоресцентного красителя был помечен ингибитор цистеиновой протеазы катепсина, что позволило метить катепсин с высокой чувствительностью и селективностью

Мечение катепсина зондом, содержащим необратимый ингибитор катепсина и флуоресцентную группу, подобную хромофору GFP. Флуоресценция нового зонда (средняя панель, структура зонда показана внизу) позволяет детектировать катепсин на белковом гель-электрофорезе, в том числе, в присутствии избытка других белков (лизат клеток HEK293) со специфичностью, превосходящей таковую стандартного метода окраски с антителами против катепсина (правая панель).

  1. Frizler M., Yampolsky I.V., Baranov M.S., Stirnberg M., Gütschow M. (2013). Chemical introduction of the green fluorescence: imaging of cysteine cathepsins by an irreversibly locked GFP fluorophore. Org. Biomol. Chem. 11, 5913;
  2. Baranov M.S., Solntsev K.M., Lukyanov K.A., Yampolsky I.V. (2013). Synthetic approach to GFP chromophore analogs from 3-azidocinnamates. Role of methyl rotors on the chromophore photophysics. Chem. Commun. 49, 5778–5780;
  3. Баранов М.С, Лукьянов К.А., Ямпольский И.В. (2013). Синтез хромофоров флуоресцентных белков и их аналогов. Биоорг. Хим. 39, 255–276;
  4. Baranov M.S., Lukyanov K.A., Ivashkin P.E., Yampolsky I.V. (2013). An efficient synthetic approach to fluorescent oxazole-4-carboxylate derivatives. Synth. Commun. 43, 2337–2342;
  5. Baranov M.S., Yampolsky I.V. (2013). Novel condensations of nitroacetic esters with aromatic aldehydes leading to 5-hydroxy-1,2-oxazin-6-ones. Tetrahedron Lett. 54, 628–629.

Лабоpатоpия биотехнологии — новые способы получения производных нуклеозидов

Разработаны способы получения 2,6-пурин-дизамещенных модифицированных нуклеозидов, содержащих в С6-положении остатки хиральных аминокислот (серина, лизина и т.п.) и неприродные остатки 3’-дезоксирибозы, арабинозы и 2’-фторарабинозы. Получены первые результаты тестирования противоопухолевой активности синтезированных соединений на клеточной линии Т-лимфобластного лейкоза U937.

Впервые с помощью пуриннуклеозидфосфорилазы E. coli получена серия из пятнадцати новых нуклеозидов на основе 4,5,6-тризамещенных бензимидазолов рибо-, 2’-дезоксирибо-, 3’-дезоксирибо- и 2’-фторарабино- рядов для тестирования противоопухолевой и противовирусной активности.

Лабоpатоpия рентгеноструктурного анализа — пространственные структуры новых флуоресцентных белков зеленого, желтого и красного спектральных диапазонов

Методами рентгеноструктурного анализа высокого разрешения и сайт-направленного мутагенеза установлены пространственные структуры и изучена структурно-функциональная взаимосвязь серии новых флуоресцентных белков (ФБ) зеленого, желтого и красного спектральных диапазонов.

Методом рентгеноструктурного анализа установлены пространственные структуры зеленого laGFP (λвозб=502 нм и λэм=511 нм), а также красного флуоресцентного белка (ФБ) дикого типа — laRFP (λвозб=521 нм и λэм=592 нм; Branchiostoma Lanceolatum) и его спектрально и структурно идентичного генно-инженерного варианта с улучшенным фолдингом — laRFP-del_S83 (с делецией остатка Ser83) при разрешениях 1.7, 2.3 и 1.9 Å, соответственно.

Это первые ФБ с установленной пространственной структурой из группы хордовых структурно неизученного подсемейства Bilaterian. Основные особенности пространственной организации зеленого laGFP близки таковым других известных зеленых ФБ. Напротив, структура laRFP впервые продемонстрировала необычные структурные черты, отсутствующие у других ФБ дикого типа из Cnidarian. Первое, у красного laRFP обнаружена необычная хромофор образующая последовательность Gly58-Tyr59-Gly60. Второе, у него обнаружен остаток Gln211 (предположительно ключевой для формирования хромофора) вместо консервативного каталитического Glu211, характерного для всех известных до сих пор природных ФБ. Третье, структура хромофора характеризуется отсутствием типичной для красных белков N-ацилиминной двойной связи, а также наличием необычной ковалентной связи между атомом (Tyr59)Cβ хромофора и гидроксильной группы ближайшего остатка Tyr62. Предполагается, что именно эта ковалентная связь в первую очередь является ответственной за наблюдаемый большой сдвиг Стокса (LSS) ~80 нм. Методом сайт-направленного мутагенеза установлены ключевые аминокислотные остатки в области хромофора красного laRFP ответственные за его необычные спектральные характеристики и предложен молекулярный механизм образования ковалентной связи между хромофором и Tyr62 в процессе пост-трансляционной модификации белка.

  1. Pletneva N.V., Pletnev V.Z., Souslova E., Chudakov D.M., Lukyanov S., Martynov V.I., Arkhipova S., Artemyev I., Wlodawer A., Dauter Z., Pletnev S. (2013). Yellow fluorescent protein phiYFPv (phialidium). Crystal structure and structure based mutagenesis. Acta Cryst. 69D, 1005–1012;
  2. Pletnev V.Z., Pletneva N.V., Souslova E.A., Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Fradkov A.F., Chepurnykh T., Wlodawer A., Dauter Z., Pletnev S. (2013). Crystal Structure of red emitting laRFP (Branchiostoma Lanceolatum): Catalytic Gln211, GYG Chromophore Covalently Bound with proximal Tyr62. Acta Cryst. 69D, 1850–1860.

Группа химии пептидов — метод синтеза амидной формы пептида HLDF-6.

Разработан метод синтеза амидной формы пептида HLDF-6. Ретросинтеческий анализ разработанного метода синтеза представлен на схеме. Ретросинтетический анализ целевого продукта, амидной формы пептида HLDF-6. Основные пути расчленения молекулы показаны волнистыми линиями и обозначены (a) и (b).

  1. Azev V.N., Mustaeva L.G., Gorbunova E.Y., et al. (2013). Formation of Truncated Peptide by-Products via Sequence-specific Formyl Group Transfer from Trp(For) Residues to Nα in the Course of Boc-SPPS. J. Pept. Sci. 19, 607–612.

Лаборатория клеточных взаимодействий — иммуностимулирующее действие миелопептидов

Продемонстрировано выраженное иммуностимулирующее действие миелопептидов МП-1, МП-3 и МП-5, совместно размещенных на полимерной молекуле-носителе. Указанная конструкция существенно увеличивала продукцию интерферона-гамма клетками иммунной системы и уровень экспрессии рецепторов, активирующих эффекторы врожденного иммунитета.

В экспериментах с лейкоцитами, выделенными из периферической крови человека, было установлено, что полученный нами совместно с лабораторией химии пептидов конъюгат миелопептидов МП-1, МП-3 и МП-5 с молекулой полилизина обладает иммуностимулирующим действием, достоверно превышающем таковой, зарегистрированный у компонентов конъюгата и их смеси. Об иммуностимулирующем эффекте созданной конструкции свидетельствовала выраженная индукция этим препаратом синтеза и секреции интерферона-гамма в культуре мононуклеаров периферической крови человека, а также значительное усиление уровня экспрессии моноцитами и нейтрофилами рецепторов TLR-2 и TLR-4.

Отдел молекулярных основ нейросигнализации — мутантные водорастворимой формы белка Lynx1 из мозга человека (совместно с Отделом биомнженерии)

Получена серия мутантов водорастворимой формы белка Lynx1 из мозга человека (ws-Lynx1), сходного по пространственной структуре с трехпетельными α-нейротоксинами змей и взаимодействующего с никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторами (нАХР).

Методами радиолигандного анализа и электрофизиологии идентифицированы аминокислотные остатки ws-Lynx1, существенные для связывания с мышечными и/или нейрональными нАХР. На основании впервые определенных констант взаимодействия ws-Lynx1 с его рецепторными мишенями установлено, что модулирующие эффекты Lynx1 на нАХР могут объясняться невысоким (микромольным) сродством и быстрой диссоциацией, в отличие от α-нейротоксинов, имеющих наномольное сродство и приводящих к необратимому ингибированию нАХР.

  1. Lyukmanova E.N., Shulepko M.A., Buldakova S.L., Kasheverov I.E., Shenkarev Z.O., Reshetnikov R.V., Filkin S.Y., Kudryavtsev D.S., Ojomoko L.O., Kryukova E.V., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P., Bregestovski P.D., Tsetlin V.I. (2013). Water-soluble LYNX1 residues important for interaction with muscle-type and/or neuronal nicotinic receptors. J. Biol. Chem. 288, 15888–15899.

Лаборатория геномики адаптивного иммунитета

Разработано открытое программное обеспечение для анализа данных массированного секвенирования Т-клеточных рецепторов (MiTCR)

Программный пакет MiTCR (http://mitcr.milaboratory.com), опубликованный в журнале Nature Methods, не имеет мировых аналогов ни по скорости, ни по качеству, ни по объему обработки предварительных данных массированного секвенирования репертуаров Т-клеточных рецепторов.

В MiTCR реализованы новые быстрые и универсальные алгоритмы для анализа данных секвенирования Т-клеточных рецепторов и коррекции содержащихся в них ошибок. Программа сделана так, чтобы ее мог использовать любой биолог в своих исследованиях. Она позволяет получать биологически значимые данные, корректно и эффективно удаляя имеющиеся в исходных предварительных данных ошибки ПЦР и секвенирования.

Код MiTCR тщательно оптимизировался для ускорения его работы. Стадии обработки и коррекции ошибок объединены в один «конвейер». Это позволяет минимизировать необходимое для обработки количество оперативной памяти и дискового пространства. Также это делает возможным потоковую однопроходную обработку данных (например, при чтении из удаленного хранилища). В модулях коррекции ошибок реализованы алгоритмы с использованием префиксных деревьев для быстрого решения задач нечеткого поиска и кластеризации нуклеотидных последовательностей. Все вычислительно затратные этапы анализа распараллелены для использования всех имеющихся в системе процессорных ядер. В результате, например, анализ типичного объема данных, получаемого с одной дорожки секвенатора HiSeq 2000 (около 130 млн. коротких последовательностей, ~ 13 млрд. нуклеотидных оснований общим объемом около 35 Гб) занимает около 20 минут на обычном компьютере (AMD Phenom II X4 955 @ 3.2 GHz; необходимый объем ОЗУ зависит от сложности образца, т.е. содержащегося в нем разнообразия Т-клеточных рецепторов, типичное значение 4–12 Гб).

MiTCR является программой с открытым исходным кодом (лицензия GPLv3), написан на Java 7 и имеет хорошо документированный API для использования из Java и Groovy приложений. Разработка велась (и продолжается) с использованием современных подходов к программированию: модульного тестирования (JUnit), распределенной системы управления версиями (Mercurial), автоматизированной системы сборки (Maven) и системы непрерывной интеграции (Teamcity). Хранилище исходного кода открыто и доступно на http://bitbucket.org. Бинарные пакеты опубликованы в центральной репозитории Maven (MavenCentralRepository).

  1. Bolotin D.A., Shugay M., Mamedov I.Z., Putintseva E.V., Turchaninova M.A., Zvyagin I.V., Britanova O.V., Chudakov D.M. (2013). MiTCR: software for T-cell receptor sequencing data analysis. Nat. Methods 10, 813–814.

Технология массированного спаривания и идентификации нативных пар α- и β- цепей Т-клеточных рецепторов с помощью эмульсионного ОТ-ПЦР, реакции перекрытия-удлинения и секвенирования нового поколения

Была продемонстрирована техническая возможность массированной идентификации нативных пар Т-клеточных рецепторов с использованием эмульсионной ОТ-ПЦР с живых клеток и секвенирования нового поколения.

Однако, разработанный нами метод принципиально ограничен узким сегментом вариантов альфа- и бета-цепей Т-клеточных рецепторов, и не может быть напрямую экстраполирован на все разнообразие Т-клеточных рецепторов. Ведется работа по совершенствованию технологии.

  1. Turchaninova M.A., Britanova O.V., Bolotin D.A., Shugay M., Putintseva E.V., Staroverov D.B., Sharonov G., Shcherbo D., Zvyagin I.V., Mamedov I.Z., Linnemann C., Schumacher T.N., Chudakov D.M. (2013). Pairing of T-cell receptor chains via emulsion PCR. Eur. J. Immunol. 43, 2507–2515.

Группа лесной биотехнологии — Трансгенное растение осины с повышенной продуктивностью и модифицированной древесиной

Завершены испытания трансгенных форм осины Populustremulaс суперэкспрессией гена глутаминсинтетазы GS1 из сосны. По результатам испытаний в условиях лаборатории, теплицы и открытой площадки отобраны и охарактеризованы два лучших клона — PtV22XGS(8)2 и PtV22IXGS(6)8. Созданные формы отличаются от исходного генотипа повышенной продуктивность, сниженным содержанием лигнинов, повышенным содержанием целлюлозы. Древесинные волокна (либриформ) данных клонов отличаются по биометрическим параметрам — увеличена толщина стенки и ширина либриформа. Длина волокон осталась неизменной.

  1. Лебедев В.Г., Шестибратов К.А. Трансгенное растение осины с повышенной продуктивностью и модифицированной древесиной. Заявка на изобретение № 2013149030. Приоритет от 05.11.2013.

Лаборатория механизмов генной экспрессии — специфические изоформы РНК-полимеразы II

Впервые найдены белковые партнёры специфичных для человека изоформ hRPB11bβ и hRPB11сβ субъединицы РНК-полимеразы II POLR2J (hRPB11) в нервной и лимфоидной тканях Homo sapiens. Среди белков-партнёров сходных между собой изоформ hRPB11bβ и hRPB11cβ (116 а.о.) обнаружены субъединица РНК-полимеразы II hRPB6 и ряд белков, участвующих в биогенезе и регуляции функционирования siRNAs (Y14 [RBM8A], DCAF, EIF6, RPS3A), в том числе новый, ранее не описанный вариант ядерной рибонуклеазы III DROSHPA, что указывает на существование у Homo sapiens нового, особого типа сопряжения процессов транскрипции и РНК-интерференции.

С помощью генетического (дрожжевая двухгибридная система) и биохимического (соосаждение белков из клеточных лизатов) подходов осуществлён полномасштабный поиск белков-партнёров описанных нами ранее вариантов субъединицы РНК-полимеразы II человека hRPB11 — hRPB11bβ, hRPB11сβ — в протеоме человека (эмбриональный мозг и клеточная линия Jurkat). В результате определён основной спектр белковых партнёров этих специфичных для человека изоформ субъединицы РНК-полимеразы II hRPB11 (POLR2J).

Среди белков-партнёров сходных между собой изоформ hRPB11b? и hRPB11cβ (116 а.о.) обнаружены субъединица РНК-полимеразы II hRPB6, новый, ранее не описанный вариант ядерной рибонуклеазы III DROSHA (RNASEN), кóровый компонент белкового комплекса экзонных сочленений EJC (exon-exon junction complex) Y14 (RBM8A), а также белки DCAF, EIF6 и RPS3A. Наличие в этом списке особого варианта инициирующей нуклеазы процессинга микроРНК (miRNAs) DROSHA и участвующих в биогенезе и регуляции функционирования siRNAs белков EIF6, RPS3A и DCAF указывает на новый тип сопряжения процессов транскрипции и РНК-интерференции у Homo sapiens.

  1. Шематорова Е.К., Шпаковский Д.Г., Шпаковский Г.В. (2013). Новые комплексы генной экспрессии и их роль в возникновении и эволюции рода Homo. Цитология 55, 172–177; Cell and Tissue Biology, 2013, v. 7, No. 4, pp. 314–319.

7 февраля 2014 года

Прикрепленные файлы:

Отчет о выполнении НИР в 2013 году
pdf, 4.71 Мб
Отчет о выполнении НИР в 2013 году (презентация)
pptx, 16.43 Мб