Пресс-центр / новости / Отчеты /

Информация о ходе выполнения проекта Минобрнауки России по Соглашению № 075- 15-2020-773

За отчетный период 4-го этапа(28.06.2023 – 31.12.2023) в рамках выполнения соглашения участниками Консорциума в результате комплексного подхода были проведены следующие работы:

1. При создании фундаментальных основ Т-клеточного реинжиниринга:

• на основе белковой пары барназа*барстар создание химерных антигенных рецепторов для получения CAR модифицированных макрофагов (CAR-M), NK (CARNK) и других иммунных клеток; исследование на клеточном уровне противоопухолевой активности регулируемых CAR-M, CAR-NK и CAR-T клеток по отдельности и в различных соотношениях;
• изучение возрастных особенностей реакции опухолевых клеток и стволовых опухолевых клеток на моделирование ортотопического рака легкого у мышей, возрастных особенностей клеточной терапии репрограммированными мышиными CD8+ Т-лимфоцитами костного мозга на модели ортотопического рака легкого у мышей, влияние коррекции спипероном эмфиземы легкого на развитие рака легкого у мышей в условиях сочетанной патологии эмфиземы легких и ортотопического рака легкого;
• анализ взаимодействия мамбалгина-2 с опухолеспецифическим протон-активируемым каналом ASIC1a/α-ENaC/γ-ENaC методами молекулярного моделирования; подтверждение интерфейс взаимодействия токсин/канал методом сайт-направленного мутагенеза; исследование механизмов процессов, запускаемых в опухолевых клетках при совместном применении мамбалгина-2 и химиотерапевтических средств, использующихся для терапии опухолей (гефитиниб, доксорубицин, паклиткасел и др.);
• продолжен поиск новых селективных модуляторов активности депо-управляемых кальциевых каналов в раковых клетках и улучшению характеристик, отобранных ранее и уже известных модуляторов.

2. Для генетического профилирования активированных цитотоксических Т-лимфоцитов:

• разработка технологии выделения и инкапсуляции В-лимфоцитов инфильтрирующих в опухоль; 
• создание библиотеки последовательностей нативно-спаренных легких и тяжелых цепей В-клеточных рецепторов, выделенных из опухолевой ткани; 
• проведение NGS секвенирование полученных библиотек.

3. Для разработки надмолекулярных комплексов для адресной доставки противораковой терапии:

• разработка наноконтейнеров, модифицированных по внешней поверхности скаффолдными направляющими и нагруженных белковыми токсинами различной природы; изучение эффективности разработанных противораковых препаратов in vitro с использованием различных раковых клеточных линий человека; разработка способа получения мини-антитела на основе вариабельного домена антитела трастузумаб для создания внутриклеточного активатора белка STING;
• разработка методики выделения и очистки мини-антитела для создания внутриклеточного активатора белка STING; получение экспериментального образца мини-антитела для создания внутриклеточного активатора белка STING и проведение оптимизации биоинженерного формата иммуноцитокина для доставки интерферона-бета к ErbB2- позитивным опухолям;
• демонстрация потенциала метода корреляционной микроскопии на примере 3-D реконструкции внутриклеточного распределения суперпарамагнитных наночастиц для магнитной гипертермии.

4. Для исследования механизмов формирования внутриопухолевой гетерогенности глиобластом:

• проведение сравнения влияния разных по механизму действия химиотерапевтических препаратов и потенциальных противоопухолевых препаратов, таких как ингибиторы сплайсинга РНК, лиганды (агонисты) «рецепторов смерти», повреждающие ДНК агенты, на различные популяции клеток глиобластомы. В результате этого сравнения отбор наиболее перспективные соединения для лечения глиобластомы, способных убивать разные по фенотипу популяции клеток глиобластомы;
• разработка тест-система для определения эффективности взаимодействий между белками, участвующими в активации механизма компенсаторной пролиферации (рецидив); получение образцов опухоли и сывороток от пациентов онкологических клиник Санкт-Петербурга и их анализ белковых реакций с помощью указанной тест-системы.

5. Для развития фундаментальных основ структурно-биологического мембранного онкотаргетинга и внутриклеточного имиджинга:

• проведение характеристики методами вычислительного эксперимента структурно-динамических аспектов взаимодействия барназы с модельными липидными бислоями, выявление сайтов связывания белок-мембрана и ключевых остатков на интерфейсе, определяющих встраивание белка в бислой;
• получение 15N,13C-изотопно меченых препаратов барназы для структурно-динамических исследований;
• проведение экспериментального наблюдения с помощью ЯМР-спектроскопии взаимодействия рибонуклеазы барназа с мембраноподобным окружением различного состава;
• проведение детализации интерфейса взаимодействия рибонуклеазы барназа с мембраноподобным окружением с помощью гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения и молекулярного моделирования;
• разработка для расширения возможностей флуоресцентного мечения вариантов метода LiveMIEL с использованием белковых зондов, обратимо связывающих флуорогенные красители, таких как белок FAST.

6. Для исследования молекулярно-генетических основ опухолевого перерождения и метастазировании:

• разработка методов биоинформатического анализа секретируемых и поверхностных маркеров лимфомы Беркитта и рака легкого;
• проведение single-cell анализа ранних событий при возникновении Лимфомы Беркитта;
• получение пассируемой раковая клеточная линия с нокаутом по гену PARP1;
• произведение оценки уровня репарации ДНК в клетках с нокаутом по генам ферментов репарации по сравнению с клетками дикого типа.

7. Для исследования роли врожденного иммунитета:

• выявление субпопуляции цитотоксических Т лимфоцитов, активированных под действием HMBP1, и характеристика молекулярных механизмов их цитотоксического действия;
• изучение влияния цитокинов на формирование цитотоксической активности HMBP1-активированных CD8+ Т лимфоцитов;
• определение продолжительности действия ингибитора субъединицы LMP2 протеасом на ее активность в клетках С26 аденокарциномы толстой кишки мыши для создания модели развития опухоли при воздействии этого ингибитора in vivo;
• проведение анализа изменений физико-химических свойств субъединицы LMP2 протеасом под действием ингибитора ее активности в клетках.

8. Для исследования регуляции клеточного метаболизма при опухолевой трансформации и старении:

• подбор условий для детекции теломерной РНК с помощью различных подходов на основе RT-qPCR на иПСК человека; отработка протокола иммуно-окрашивания, совмещенного с РНК FISH на иПСК человека; выявление маркеров повреждения ДНК при дисфункции теломер у Drosophila melanogaster;
• проведение индукции пренатального системного воспаления у грызунов цитокином ИЛ-6; исследование влияния ИЛ-6, блокатора рецептора к ИЛ-6 и поликлонального IgG на миграцию ГРГ-нейронов в мозг у грызунов в моделях ex vivo и in vivo;
• анализ роли транскрипционного фактора HSF1, белков теплового шока, протеасом и биосинтеза гема при морфогенетической миграции клеток базальных животных (губки, трихоплакс); определение динамики экспрессии белков теплового шока HSP70, ALAD, ферритина на уровне транскрипции; определение содержания активных форм фермента ALAD, участвующего в синтезе гема, у базальных животных в условиях, требующих клеточную адаптацию (разные температурные режимы и режимы оксигенации); анализ особенности пулов протеасом, белков обмена железа (ALAD и ферритина), плотности митохондрий клеток млекопитающих, различающихся по выраженности адгезионных свойств и миграционной активности (опухолевые клетки человека HeLa, клетки линии BSC-1 млекопитающих, выделенные из почечного эпителия, мезенхимальные стволовые клетки млекопитающих, функционирующие в условиях гипоксии и использующие факторы метаболических путей и регулируемые железом белки при низких концентрациях кислорода);
• получение клеточной линии для исследования транспорта конститутивных протеасом в составе внеклеточных везикул, для чего необходимо: а) получение лентивирусных конструкций для флуоресцентного мечения двух субъединиц протеасом с использованием технологии Split-GFP; б) получение лентивирусов, оценка вирусного титра и трансдукция клеток эмбриональной почки человека; в) сортировка клеток по флуоресценции; г) оценка интеграции вставки в геном, характеристика экспрессии флуоресцентно-меченных субъединиц протеасом в клетках;
• характеристика нарушения внутриклеточного редокс-метаболизма, ассоциированных со старением мезенхимных стволовых клеток человека.

9. Для исследования основ клеточного репрограммирования клеток различного происхождения:

• анализ возрастных изменений в структурах глаза: определение относительного содержания токсичных (окисленных) форм бисретиноидов в клетках ретинального пигментного эпителия в зависимости от возраста;
• разработка способа доставки Сертоли-подобных клеток в организм реципиента, максимально сохраняющего их жизнеспособность и регенерационный потенциал;
• разработка модели in vitro для изучения направленной миграции клеток в поджелудочную железу с целью выбора эффективного клеточного индуктора регенерации эндокринной части поджелудочной железы; анализ механизмов взаимодействия клеток, показавших направленную миграцию в поджелудочную железу, с клетками эндокринной части поджелудочной железы; создание лентивирусных конструкций, несущих в себе гены (кодирующие ростовые факторы, участвующие, в адаптации бета клеток поджелудочной железы во время беременности, а также глюкагоноподобного пептида – 1), нацеленные на активацию пролиферации и неогенеза бета клеток поджелудочной железы; проведение лентивирусной трансдукции разработанными векторами (в том числе, разработанными на предыдущем этапе) клеток, показавших направленную миграцию в поджелудочную железу, для дальнейшего использования их в качестве вектора для доставки вышеупомянутых факторов в поджелудочную железу, с целью изучения возможности индукции регенерации эндокринной части поджелудочной железы;
• разработка системы контроля выполнения записи транскрипции в клетках млекопитающих;
• получение секретомов и проведение их фракционирования на везикулярную и растворимые фракции из кондиционированной среды дермальных фибробластов человека на различных пассажах, в том числе при длительном культивировании

В результате выполнения работ четвертого, заключительного этапа работ по Соглашению № 13.1902.21.0041 о предоставлении субсидии Участниками консорциума получены нижеследующие основные результаты:

1. При создании фундаментальных основ Т-клеточного реинжиниринга получены: химерные антигенные рецепторы для получения CAR модифицированных макрофагов (CAR-M), NK (CAR-NK) и других иммунных клеток;

бόльшая агрессивность LLC у «старых» мышей по сравнению с «молодыми» мышами обусловлена более высоким количеством ЦОК и СОК; клеточная терапия рCD8+Т-лимфоцитами снижает активность опухолевого процесса в легких «старых» мышей; противоопухолевый эффект рCD8⁺T-лимфоцитами у «старых» мышей уступает таковому у «молодых» мышей, что объясняется увеличением числа ЦОК и СОК с фенотипом CD45^-Axl⁺, PD-L1⁺, PD-L1⁺Ki67⁺ и CD3^-CD4^-CD8^-PD-L1, резистентных к клеточной терапии; сочетание эмфиземы легких и ортотопического рака легкого характеризуется бόльшей активностью опухолевого процесса и метастазирования, чем при ортотопическом раке легкого; в условиях сочетания эмфиземы легких и ортотопического рака легкого антагонист дофаминовых Д2 рецепторов спиперон оказывает противовоспалительное действие и сохраняет структуру альвеол, препятствует росту опухоли в легких и развитию метастатической болезни;

токсин мамбалгин-2 образует дополнительные ионные и гидрофобные контакты с комплементарной субъединицей γ-ENaC(-). Сайт-направленный мутагенез остатков мамбалгина-2 и субъединицы γ-ENaC(-) подтвердил обнаруженный механизм взаимодействия токсин/канал; обнаружен аддитивный эффект мамбалгина-2 с гефитинибом и показано, что совместная обработка клеток метастатической меланомы этими веществами приводит к изменению в них баланса транскрипционных факторов c-fos и c-jun, а также уменьшению в них экспрессии маркера стволовых клеток CD133;

новые селективные модуляторы активности депо-управляемых кальциевых каналов в раковых клетках и улучшению характеристик, отобранных ранее и уже известных модуляторов. (ИБХ РАН, НИИОПП, ИНЦ РАН)

2. Для генетического профилирования активированных цитотоксических Т-лимфоцитов получены:

технология выделения и инкапсуляции В-лимфоцитов инфильтрирующих в опухоль; создана библиотека последовательностей нативно-спаренных легких и тяжелых цепей В-клеточных рецепторов, выделенных из опухолевой ткани; проведено NGS секвенирование полученных библиотек (ИБХ РАН)

3. Для разработки надмолекулярных комплексов для адресной доставки противораковой терапии получены:

наноконтейнеры, модифицированные по внешней поверхности скаффолдными направляющими и нагруженные белковыми токсинами различной природы; изучена эффективность разработанных противораковых препаратов in vitro с использованием различных раковых клеточных линий человека;

определен способ получения мини-антитела на основе вариабельного домена антитела трастузумаб для создания внутриклеточного активатора белка STING; создана методика выделения и очистки миниантитела для создания внутриклеточного активатора белка STING; получен экспериментальный образцец мини-антитела для создания внутриклеточного активатора белка STING и оптимизирован биоинженерный формат иммуноцитокина для доставки интерферона-бета к ErbB2-позитивным опухолям;

продемонстрирован потенциал метода корреляционной микроскопии на примере 3-D реконструкции внутриклеточного распределения суперпарамагнитных наночастиц для магнитной гипертермии (ИБХ РАН).

4. Для исследования механизмов формирования внутриопухолевой гетерогенности глиобластом получены:

определены два типа потенциальных терапевтических агента, различных как по структуре, так и по механизму действия – рекомбинантный TRAIL и низкомолекулярные ингибиторы серин/треонин-тирозиновых протеинкиназ DYRK/CLK, имеющие общее пиридо[3,4-g]хиназолиновое ядро – соединения 1 и 2, соответственно;

клетки первичных культур мультиформной глиобластомы (ГБМ) резистентны к рекомбинантному TRAIL дикого типа, причем на чувствительность клеток к данному лиганду не влияют ни уровни рецепторов TRAIL (1), ни наличие или отсутствие на поверхности клеток маркера CD133; продемонстрировна низкая эффективность соединения 1 в отношение клеток ГБМ; соединение 2 эффективно ингибирует изоферменты DYRK3 и CLK4 в наномолярных концентрациях, оказывая более сильный по сравнению с веществом 1 цитотоксический эффект на клетки ГБМ; вещество 2 влияет на гены, которые выполняют критически важные функции для раковых клеток, включая реакцию на повреждение ДНК, р53-опосредованный путь передачи сигналов и транскрипцию; соединение 2 (низкомолекулярные ингибиторы с общим пиридо[3,4-g]хиназолиновым ядром) определено в качестве перспективного средства для терапии глиобластомы;

получены, очищены и проверены по специфичности поликлональные антитела для использования в разработанной тест-системе выявления комплексов белков-аларминов (DAMP), которые запускают аутокринную систему регуляции опухолевого рецидива; получены и проанализированы с помощью иммуноблоттинга образцы опухоли и сыворотки от пациентов онкологических клиник г. Санкт-Петербург (ИБХ РАН, ИНЦ РАН).

5. Для развития фундаментальных основ структурно-биологического мембранного онкотаргетинга и внутриклеточного имиджинга получены:

15N,13C-изотопно меченые препараты барназы для структурно-динамических исследований и приведен Акт их получения; методами вычислительного эксперимента структурно-динамических аспектов охарактеризовано взаимодействие барназы с модельными липидными бислоями; выявлены сайты связывания белокмембрана и ключевых остатков на интерфейсе, определяющих встраивание белка в бислой; с помощью ЯМР-спектроскопии определены взаимодействия рибонуклеазы барназа с мембраноподобным окружением различного состава; проведена детализация интерфейса взаимодействия рибонуклеазы барназа с мембраноподобным окружением с помощью гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения и молекулярного моделирования; для расширения возможностей флуоресцентного мечения разработаны варианты метода LiveMIEL с использованием белковых зондов, обратимо связывающих флуорогенные красители, таких как белок FAST (ИБХ РАН).

6. Для исследования молекулярно-генетических основ опухолевого перерождения и метастазировании получены: разработаны методы биоинформатического анализа секретируемых и поверхностных маркеров лимфомы Беркитта и рака легкого и представлен их отдельный документ в составе ОД;

single-cell анализ ранних событий при возникновении лимфомы Беркитта;

набор клеточных клонов линии А549 (аденокарцинома легкого человека), с использованием метода CRISPR-Cas9, с делециями в области конститутивных белок-кодирующих экзонов генов TDP1 или PARP1; среди мутантов А549 по гену TDP1 было выбрано три клона, содержащих гомозиготные делеции в третьем экзоне – первом кодирующем экзоне гена TDP1; среди мутантов по гену PARP1 на основе линии А549 было получено четыре клеточных клона, содержащих делецию экзонов 3-5 гена PARP1 по одному аллелю;

количество PAR поли[АДФ-рибозы], синтезированной в экстрактах клеток НЕК293А и HEK293FT с нокаутом по гену PARP1 (PARP1-/-), ниже, чем в экстрактах клеток НЕК293А и HEK293FT дикого типа, и в экстрактах клеток с нокаутом по гену белка TDP1 (ИБР РАН, ИХБФМ СО РАН).

7. Для исследования роли врожденного иммунитета получены:

субпопуляции цитотоксических Т лимфоцитов, активированных под действием HMBP1 и характеризованы молекулярные механизмы их цитотоксического действия; HMGB1 индуцирует активацию TREM-1 пути;

влияние цитокинов на формирование цитотоксической активности HMBP1- активированных CD8+ Т лимфоцитов; HMGB1 способствует активации неканонических цитотоксических Т-лимфоцитов, способных лизировать HLA-негативные опухолевые клетки;

продолжительность действия ингибитора субъединицы LMP2 протеасом на ее активность в клетках С26 аденокарциномы толстой кишки мыши для создания модели развития опухоли при воздействии этого ингибитора in vivo;

анализ изменений физико-химических свойств субъединицы LMP2 протеасом под действием ингибитора ее активности в клетках (ИБГ РАН, ИБР РАН).

8. Для исследования регуляции клеточного метаболизма при опухолевой трансформации и старении получены:

условия для детекции теломерной РНК с помощью различных подходов на основе RT-qPCR на иПСК человека; отработан протокол иммуно-окрашивания, совмещенный с РНК FISH на иПСК человека и представлен отдельным документов в ОД за 4 этап; выявлены маркеры повреждения ДНК при дисфункции теломер у Drosophila melanogaster; индукция пренатального системного воспаления у грызунов цитокином ИЛ-6;

исследовано влияние ИЛ-6, блокатора рецептора к ИЛ-6 и поликлонального IgG на миграцию ГРГнейронов в мозг у грызунов в моделях ex vivo и in vivo.

4.8.3 Анализ роли транскрипционного фактора HSF1, белков теплового шока, протеасом и биосинтеза гема при морфогенетической миграции клеток базальных животных (губки, трихоплакс); определение динамики экспрессии белков теплового шока HSP70, ALAD, ферритина на уровне транскрипции; определение содержания активных форм фермента ALAD, участвующего в синтезе гема, у базальных животных в условиях, требующих клеточную адаптацию (разные температурные режимы и режимы оксигенации); анализ особенности пулов протеасом, белков обмена железа (ALAD и ферритина), плотности митохондрий клеток млекопитающих, различающихся по выраженности адгезионных свойств и миграционной активности (опухолевые клетки чело-века HeLa, клетки линии BSC-1 млекопитающих, выделенные из почечного эпителия, мезенхимальные стволовые клетки млекопитающих, функционирующие в условиях гипоксии и использующие факторы метаболических путей и регулируемые железом белки при низких концентрациях кислорода).

с применением лентивирусной трансдукции была получена генетически модифицированная клеточная линия HEK293T – SGS4, экспрессирующая гены химерных субъединиц протеасом β2-VC155 и β5-VN155. Была показана эффективная интеграция вирусной экспрессионной кассеты в геном клеток, а также выявлено наличие химерных белков в лизатах клеток. Данная модификация позволяет на основе флуоресценции белка Venus визуализировать конститутивные протеасомы внутри клеток, что облегчает изучение УПС при помощи флуоресцентной микроскопии. В целом, полученная клеточная модель станет удобным инструментом для детального изучения пула внутриклеточных протеасом, их динамического перераспределения между различными клеточными компартментами, а также их ассоциации с другими клеточными белками;

характеристика нарушения внутриклеточного редокс-метаболизма, ассоциированного со старением мезенхимных стволовых клеток человека. (ИМБ РАН, ИБР РАН, ИНЦ РАН).

9. Для исследования основ клеточного репрограммирования клеток различного происхождения получены:

анализ возрастных изменений в структурах глаза (определение относительного содержания токсичных (окисленных) форм бисретиноидов в клетках ретинального пигментного эпителия в зависимости от возраста);

способ доставки Сертоли-подобных клеток в организм реципиента, максимально сохраняющий их жизнеспособность и регенерационный потенциал.

модель in vitro для изучения направленной миграции клеток в поджелудочную железу с целью выбора эффективного клеточного индуктора регенерации эндокринной части поджелудочной железы; анализ механизмов взаимодействия клеток, показавших направленную миграцию в поджелудочную железу, с клетками эндокринной части поджелудочной железы; созданы лентивирусные конструкции, несущие гены (кодирующие ростовые факторы, участвующие в адаптации бета клеток поджелудочной железы во время беременности, а также глюкагоноподобного пептида – 1), нацеленные на активацию пролиферации и неогенеза бета клеток поджелудочной железы; проведена лентивирусной трансдукции разработанными векторами (в том числе, разработанными на предыдущем этапе) клеток, показывающих направленную миграцию в поджелудочную железу, для дальнейшего использования их в качестве вектора для доставки вышеупомянутых факторов в поджелудочную железу, с целью изучения возможности индукции регенерации эндокринной части поджелудочной железы;

система контроля выполнения записи транскрипции в клетках;

получен секретом и проведено его фракционирование на везикулярную и растворимые фракции из кондиционированной среды дермальных фибробластов человека на различных пассажах, в том числе при длительном культивировании; методом прямого репрограммирования из дермальных фибробластов на различных пассажах получены индуцированные нейроны; проведена частичная оценка эффективности репрограммирования фибробластов в нейроны в зависимости от пассажа, на котором находятся фибробласты по выживаемости клеток (ИНЦ РАН, ИБР РАН).

Проведенные по проекту исследования соответствует мировому уровню.

Все задачи четвертого этапа работ выполнены в установленные сроки в соответствии с планом фундаментальных исследований Соглашения № 075-15-2020-773 (внутренний номер 13.1902.21.0041) о предоставлении субсидии от 30 сентября 2020 г.

24 января

<form action="" method="post" class="commentForm" id="commentForm-{0}"> <input type="hidden" name="pressId" value="4757" /> <input type="hidden" name="parentId" value="{1}" /> <input type="hidden" name="id" value="{2}" /> <txt name="comment_text" id="comment_text">{3}</txt> <input type="button" class="button" value="Комментировать" /> <a class="button" href="javascript:void(null)">Отмена</a> <span class="wait">Подождите немного...</span> <div class="clear"></div> </form>